華中地區(qū)不同品種樹莓果實(shí)成熟過程中特征活性物質(zhì)的變化

李璐，徐玉娟，吳繼軍，余元善，鄒波，彭健

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510610）

樹莓（Rubus corchorifoliusL. f.），薔薇科懸鉤子屬小漿果，又稱山莓、覆盆子，是一種重要的園藝作物，分布于全球溫帶地區(qū)，尤其是美洲和歐洲[1,2]，在我國主要分布于東北、華北等地區(qū)，其果實(shí)營養(yǎng)價(jià)值豐富、風(fēng)味獨(dú)特廣受消費(fèi)者喜愛[3]。樹莓果實(shí)中富含花青素、黃酮、鞣花單寧等對人體有益的多種活性物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化、抗糖尿病和抗癌等功效[4-6]，有著“金色水果”的美譽(yù)[5]。在我國，樹莓自古以來就被廣泛用于腎遺尿和尿頻的治療，具有極高的藥用價(jià)值[7]。然而，樹莓果實(shí)保質(zhì)期極短，當(dāng)樹莓果實(shí)成熟后，由于其呼吸速率較高，導(dǎo)致其硬度和新鮮度迅速下降，極易發(fā)生腐爛變質(zhì)現(xiàn)象[8]。將東北、華北地區(qū)的樹莓運(yùn)輸至華中地區(qū)，腐爛率較一般水果高，因此，華中地區(qū)市面上可供鮮食的樹莓果實(shí)較少[3,9]。近年來，樹莓在華中地區(qū)栽培成功，減少了運(yùn)輸成本。但不同種植地區(qū)樹莓果實(shí)的營養(yǎng)物質(zhì)組成和含量存在較大差異，目前尚未有關(guān)于華中地區(qū)樹莓果實(shí)特征性活性物質(zhì)的研究，制約了華中地區(qū)樹莓果實(shí)的開發(fā)利用。

酚類物質(zhì)是水果中一類重要的活性物質(zhì)，其含量受多種因素影響，例如生長環(huán)境、品種和成熟階段等[10]。有研究表明，成熟的蔓越莓果實(shí)中總酚含量遠(yuǎn)高于未成熟蔓越莓果實(shí)[11]，而成熟蘋果中總酚含量顯著低于未成熟蘋果[8]。水果中的酚類物質(zhì)大體可分為花色苷類和非花色苷類酚類物質(zhì)?；ㄉ帐怯绊懰珴珊统墒於鹊闹匾蛩?，通常在水果成熟過程中積累[8]。鞣花單寧是懸鉤子屬漿果中一類特有的非花色苷類酚類物質(zhì)[12]。研究發(fā)現(xiàn)，花色苷和鞣花單寧是樹莓果實(shí)中重要的活性物質(zhì)，具有清除自由基、抗癌等功能[6,8]。其中，矢車菊素3-O-槐糖苷、矢車菊素3-O-葡萄糖苷、地榆素H-6和Lambertianin C是樹莓果實(shí)中含量較高的酚類物質(zhì)[13]。然而，不同品種樹莓果實(shí)酚類物質(zhì)的組成和含量具有較大差異[8]。

超氧化物歧化酶是一種具有抗氧化活性的金屬酶，是對抗超氧陰離子自由基的第一道防線[14]。機(jī)體內(nèi)超氧陰離子自由基的存在會導(dǎo)致癌癥、心血管疾病和衰老。因此，超氧化物歧化酶被報(bào)道具有抗癌、抗衰老的作用[15]，常作為一種外源添加劑添加至醫(yī)藥、飲料和保健食品中[16]。目前，超氧化物歧化酶主要從動物體內(nèi)獲得，但這存在生物污染和倫理道德問題[17]。因此，研究人員對具有高活性超氧化物歧化酶植物的關(guān)注日益增加[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，超氧化物歧化酶是樹莓中主要的抗氧化物質(zhì)[18]。因此，超氧化物歧化酶可作為樹莓果實(shí)的特征活性物質(zhì)。然而，目前關(guān)于樹莓果實(shí)超氧化物歧化酶的研究較少?；诖?，本研究通過分析四種生長在華中地區(qū)的樹莓在其果實(shí)成熟過程中總酚、總花色苷、花色苷類酚類物質(zhì)、非花色苷類酚類物質(zhì)和超氧化物歧化酶的變化，解析華中地區(qū)不同品種樹莓果實(shí)成熟過程中特征活性物質(zhì)的變化規(guī)律，為華中地區(qū)樹莓果實(shí)的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

秋福、美22、哈爾特茲和天門三號樹莓果實(shí)采自湖北天門樹莓園，根據(jù)表1將其成熟過程分為4個(gè)階段。密封冷凍避光運(yùn)回廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，-20 ℃保藏。標(biāo)準(zhǔn)品：矢車菊素3-O-槐糖苷、矢車菊素3-O-葡萄糖苷、矢車菊素3-O-蕓香苷、天竺葵素3-O-葡萄糖苷、樹莓酮、鞣花酸和沒食子酸，購自于上海源葉生物科技有限公司。其他試劑均購自于廣州市泰昌生物科技有限公司。

表1 樹莓果實(shí)成熟階段的分級標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Grading criteria for raspberry fruits ripening stages

1.2 主要儀器與設(shè)備

LLJ-206J多功能料理機(jī)，江門市貝爾斯頓電器有限公司；UV-1900i紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；Infinite M200pro酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司；LC-20AT高效液相色譜儀，日本島津公司；高效液相色譜四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀，加拿大SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 樹莓果實(shí)活性物質(zhì)含量測定

1.3.1.1 酚類化合物的提取

將樹莓果實(shí)均勻制漿，精確稱取10 g勻漿液加入到10 mL提取液（甲醇:鹽酸=99:1）30 ℃超聲處理10 min，5000 r/min離心5 min，收集上清液，沉淀繼續(xù)提取3次，合并上清液，用于酚類化合物和抗氧化活性的評價(jià)[19]。

1.3.1.2 總酚含量的測定

采用Folin Ciocalten法[8]對樹莓果實(shí)總酚含量進(jìn)行測定，將1 mL提取液與2 mL斐林試劑和2 mL碳酸鈉溶液混合，混合液避光反應(yīng)60 min，于760 nm處檢測其吸光值，樹莓果實(shí)總酚含量以每克樹莓果實(shí)中沒食子酸當(dāng)量（毫克）數(shù)計(jì)。

1.3.1.3 總花色苷含量的測定

采用pH示差法[8]對樹莓果實(shí)總花色苷含量進(jìn)行測定，將提取液分別加入到0.025 mol/L KCl（pH=1.0）和0.4 mol/L CH3COONa（pH=4.5）中，均勻混合后避光反應(yīng)15 min，分別在510 nm和700 nm處檢測吸光值。樹莓果實(shí)總花色苷含量按照公式（1）進(jìn)行計(jì)算：

式中：

MW=449.2；

ε——矢車菊素3-葡萄糖苷摩爾消光系數(shù)，29600 L/(mol·cm)；

A510、A700——510 nm、700 nm處的吸光值。

1.3.1.4 鞣花單寧的提取

鞣花單寧的提取參考Micha?Sójka等[20]的方法。將樹莓果實(shí)均勻制漿，精確稱取10 g勻漿液加入到30 mL 60%丙酮提取液，30 ℃超聲處理10 min，5000 r/min離心5 min，收集上清液，沉淀繼續(xù)提取2次，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除丙酮后采用XAD 1600N大孔吸附樹脂對其進(jìn)行純化，收集40%乙醇洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后用于鞣花酸和鞣花單寧的結(jié)構(gòu)鑒定。

1.3.1.5 樹莓果實(shí)中花色苷的結(jié)構(gòu)鑒定

樹莓果實(shí)中花色苷的結(jié)構(gòu)鑒定使用高效液相色譜四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行，方法參考Micha?Sójka等[20]的方法，并略有改動。取1 mL提取液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后待測。色譜條件：色譜柱為Wondasil C18柱（250×4.6 mm，5 μm，日本島津）；流動相為4%磷酸溶液（A）和乙腈（B）。洗脫程序?yàn)椋?～10 min，8% B；10～55 min，8%～18% B；55～65 min，18%～45% B；65～65.01 min，45%～70% B，65.01～70 min，70%～70% B。進(jìn)樣量為10 μL，流速為1 mL/min，檢測器為二極管陣列檢測器，柱溫為35 ℃。質(zhì)譜條件：電噴霧電離離子源（ESI），正離子掃描模式，掃描范圍100～1000 u，毛細(xì)管電壓4.5 kV，霧化器壓力1.5 bar，毛細(xì)管溫度220 ℃，干燥氣體流速6.0 L/min。

1.3.1.6 樹莓果實(shí)中鞣花酸和鞣花單寧的結(jié)構(gòu)鑒定

樹莓果實(shí)中鞣花酸和鞣花單寧的結(jié)構(gòu)鑒定使用高效液相色譜四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行，方法參考Micha?Sójka等[20]的方法。取1 mL提取液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后待測。色譜條件同花色苷的結(jié)構(gòu)鑒定。質(zhì)譜條件：電噴霧電離離子源（ESI），負(fù)離子掃描模式，一級質(zhì)譜掃描范圍100～2000 u，二級質(zhì)譜掃描范圍100～1500 u，毛細(xì)管電壓4.0 kV，霧化器壓力1.5 bar，毛細(xì)管溫度400 ℃，干燥氣體流速20.0 L/min。

1.3.1.7 樹莓果實(shí)中酚類化合物的定量分析

采用高效液相色譜法測定樹莓果實(shí)中酚類化合物的含量。液相色譜條件同結(jié)構(gòu)鑒定，外標(biāo)法定量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)曲濃度范圍為2.5～100 μg/mL，鞣花單寧以鞣花酸含量定量。

1.3.1.8 樹莓果實(shí)中超氧化物歧化酶活性的測定

使用比色分析試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司）根據(jù)說明書檢測樹莓果實(shí)中的超氧化物歧化酶的活性[21]。

1.3.2 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，數(shù)據(jù)以為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Excel、Origin 8.5、SPSS 23、PeakView對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 四種樹莓果實(shí)成熟過程中總酚和總花色苷含量的變化

眾所周知，由于漿果類水果含有豐富的活性物質(zhì)，使其具有多種生物活性，例如抗氧化、抗癌、擴(kuò)張血管和抗菌等[22]。其中，起主要作用的物質(zhì)是酚類化合物[23]。因此，評價(jià)不同種類樹莓成熟過程中總酚含量的變化是尤為必要的。根據(jù)樹莓果實(shí)的顏色將其成熟過程分為四個(gè)階段（表1）：S1階段（綠色）、S2階段（粉色）、S3階段（紅）和S4階段（深紅）。由圖1a可知，隨著樹莓果實(shí)的成熟，其總酚含量呈下降趨勢。樹莓果實(shí)總酚含量最高的階段在S1，其中美22樹莓果實(shí)中的總酚物質(zhì)含量最高（31.94 mg/g FW），與已有報(bào)道結(jié)果是一致的[8]。而在S3和S4階段，四種樹莓果實(shí)的總酚含量沒有顯著性差異。

圖1 四種樹莓果實(shí)成熟過程中總酚（a）和總花色苷（b）含量的變化Fig.1 Changes in total phenolics (a) and total anthocyanins (b)contents of four cultivars during raspberry fruit ripening

有研究表明，樹莓果實(shí)含有較高的花色苷含量，使其具有較強(qiáng)的抗氧化活性[23]。因此，針對四種樹莓果實(shí)成熟過程中總花色苷含量的變化也進(jìn)行了研究。由圖1b可知，四種樹莓果實(shí)成熟過程中總花色苷含量呈上升趨勢，從其顏色的變化也可看出，樹莓果實(shí)成熟過程中其顏色逐漸由綠變紅；在S4階段，四種樹莓果實(shí)的總花色苷含量均達(dá)到最高，其中美22樹莓果實(shí)總花色苷含量最高（1311.27 mg/kg FW），這表明樹莓果實(shí)中花色苷的形成和積累主要發(fā)生在樹莓果實(shí)成熟過程中的S4階段。Yang等[8]也發(fā)現(xiàn)樹莓果實(shí)成熟過程中總花色苷含量不斷升高，尤其在樹莓果實(shí)成熟的末期，其總花色苷含量急劇升高。

2.2 樹莓果實(shí)酚類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定

花色苷是一類重要的天然有機(jī)化合物，廣泛存在于漿果中，它不僅可用為食用型色素，而且對預(yù)防腫瘤、心血管等疾病有重要作用[5]。鞣花單寧與花色苷均是樹莓果實(shí)的代表性酚類化合物。為進(jìn)一步研究樹莓果實(shí)成熟過程中特征活性物質(zhì)的變化，采用高效液相色譜聯(lián)合四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜對樹莓果實(shí)單體酚進(jìn)行解析。根據(jù)一級質(zhì)譜分子量、二級碎片以及紫外可見光譜、標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間及參考文獻(xiàn)，共鑒定出9種單體酚，包括5種花色苷，矢車菊素3-O-槐糖苷、矢車菊素3-(2''-O-葡萄糖)蕓香苷、矢車菊素3-O-葡萄糖苷、矢車菊素3-O-蕓香苷和天竺葵素3-O-葡萄糖苷；3種鞣花單寧，Lambertianin C，地榆素H-6（sanguiin H-6），鞣花酸；樹莓酮（表2）。

表2 液相質(zhì)譜聯(lián)用鑒定樹莓果實(shí)中花色苷類和非花色苷類酚類化合物Table 2 LC-MS Identification of anthocyanin and non- anthocyanin phenolic compounds in raspberry fruit

酚類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定以矢車菊素3-O-槐糖苷為例，其他化合物的結(jié)構(gòu)鑒定類似。根據(jù)[M+H]+精確母離子分子量611.16068 u推測其分子式為C27H31O16，二級碎片ms/287為典型的矢車菊素分子量，ms/449與ms/287相差162 u，推測為矢車菊素六碳糖苷，ms/611與ms/449相差162 u，推測為矢車菊素-六碳糖-六碳糖苷，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間，以及標(biāo)準(zhǔn)品相同的紫外可見光譜圖（λmax279 nm和515 nm），確定其為矢車菊素3-O-槐糖苷。

2.3 樹莓果實(shí)成熟過程中花色苷的變化

從表3可以看出，品種和成熟階段對樹莓果實(shí)花色苷組成和含量影響較大；矢車菊素3-O-槐糖苷，矢車菊素3-O-葡萄糖苷，矢車菊素3-(2''-O-葡萄糖)蕓香苷和矢車菊素3-O-蕓香苷是樹莓果實(shí)中主要的花色苷，與已有研究結(jié)果是相同的[13,24]。矢車菊素3-O-槐糖苷和矢車菊素3-O-葡萄糖苷在四種樹莓果實(shí)中均可檢測到，在秋福、美22和天門三號樹莓果實(shí)中均可檢測到矢車菊素3-(2''-O-葡萄糖)蕓香苷和矢車菊素3-O-蕓香苷，而天竺葵素3-O-葡萄糖苷僅在美22和哈爾特茲樹莓果實(shí)中檢測到。5種花色苷類化合物在樹莓果實(shí)的成熟過程中均呈上升趨勢。四種樹莓果實(shí)完全成熟時(shí)，花色苷含量為美22（1311.3 mg/kg FW）>秋福（766.46 mg/kg FW）>哈爾特茲（755.96 mg/kg FW）>天門三號（565.73 mg/kg FW）；秋福中矢車菊素3-O-蕓香苷的含量最高（171.14 mg/kg FW）；美22樹莓果實(shí)中矢車菊素3-O-葡萄糖苷和天竺葵素3-O-葡萄糖苷的含量最高，分別為797.94和19.45 mg/kg FW；哈爾特茲樹莓果實(shí)中矢車菊素3-O-槐糖苷的含量最高（473.05 mg/kg FW）；天門三號樹莓果實(shí)中矢車菊素3-(2''-O-葡萄糖)蕓香苷的含量最高（196.48 mg/kg FW）。以上結(jié)果表明，不同品種樹莓果實(shí)成熟過程中其花色苷組成和含量存在差異[25]。Chen等[26]研究了15種樹莓果實(shí)中花色苷的含量和組成，根據(jù)花色苷的組成和含量可將15種樹莓果實(shí)分為3組，深紅色和黑色樹莓果實(shí)組的花色苷含量均達(dá)4633 mg/100 g DW，且其主要的花色苷類酚類化合物為矢車菊素3-O-葡萄糖苷和矢車菊素3-O-蕓香苷；而粉紅色組樹莓果實(shí)花色苷含量僅有704 mg/100 g DW，其主要花色苷類為矢車菊素3-O-槐糖苷和矢車菊素3-（2''-O-葡萄糖）蕓香苷。Yang等[8]也發(fā)現(xiàn)不同成熟階段樹莓果實(shí)中花色苷類化合物組成和含量有較大差異。

表3 四種樹莓果實(shí)成熟過程中5種花色苷酚類化合物的含量（mg/kg FW）Table 3 Quantification of 5 anthocyanin phenolic compounds in four cultivars at different ripening stages of raspberry fruit

2.4 四種樹莓果實(shí)成熟過程中非花色苷酚類物質(zhì)含量的變化

從四種樹莓果實(shí)中共鑒定出4種非花色苷類酚類物質(zhì)，分別是Lambertianin C、地榆素H-6、樹莓酮和鞣花酸（表4）。其中，鞣花酸、Lambertianin C和地榆素H-6屬于鞣花單寧類物質(zhì)[20]。而樹莓酮是唯一一種能夠產(chǎn)生天然樹莓果實(shí)果香的物質(zhì)，可有效促進(jìn)脂質(zhì)代謝，從而達(dá)到減脂的作用[27]。四種樹莓果實(shí)中Lambertianin C和地榆素H-6的含量均遠(yuǎn)高于鞣花酸的含量，與已有報(bào)道結(jié)果一致[23]，鞣花鞣質(zhì)類化合物只有經(jīng)酸解或堿解后才會大量形成鞣花酸。Gasperotti等[28]也發(fā)現(xiàn)Polka和Polana樹莓品種果實(shí)中的Lambertianin C和地榆素H-6含量占總鞣花單寧類物質(zhì)含量的64%。除秋福樹莓果實(shí)外，美22、哈爾特茲和天門三號樹莓果實(shí)在其成熟過程中Lambertianin C，地榆素H-6和樹莓酮的含量均呈逐漸下降的趨勢。而鞣花酸在四種樹莓果實(shí)成熟過程中均呈先下降后上升的趨勢。當(dāng)四種樹莓果實(shí)完成成熟時(shí)，美22樹莓果實(shí)中Lambertianin C、地榆素H-6、樹莓酮和鞣花酸的含量均為最高，分別為166.27、208.93、2.64和33.02 μg/g FW。

表4 四種樹莓果實(shí)成熟過程中4種非花色苷酚類物質(zhì)的含量（μg/g FW）Table 4 Quantification of 4 non-anthocyanin phenolic compounds in four cultivars at different ripening stages of raspberry fruit

2.5 四種樹莓果實(shí)成熟過程中超氧化物歧化酶活性的變化

水果中天然存在的內(nèi)源性酶對其質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味和顏色有較大影響，例如酯酶和果膠酶能夠直接影響水果的成熟度和風(fēng)味[29,30]。超氧化物歧化酶也是一種水果中常見的內(nèi)源性酶，它可以用來反映水果的抗氧化活性，具有抗癌、抗心血管疾病和延緩衰老等功能[14]。因此，研究樹莓果實(shí)過程中超氧化物歧化酶活性的變化是尤為必要的。如圖2所示，除美22樹莓果實(shí)外，其他三種樹莓果實(shí)成熟過程中超氧化物歧化酶的活性均呈下降趨勢，而美22樹莓果實(shí)成熟過程中超氧化物歧化酶的活性呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)樹莓果實(shí)完全成熟后，天門三號樹莓果實(shí)中超氧化物歧化酶的活性是最低的，僅有495.01 U/g FW。以上結(jié)果表明，四種樹莓果實(shí)成熟過程中超氧化物歧化酶活性總體呈下降趨勢。

圖2 四種樹莓果實(shí)成熟過程中總超氧化物歧化酶活性的變化Fig.2 Changes in superoxide dismutase activity of four cultivars during raspberry fruit ripening

3 結(jié)論

本研究解析了不同成熟階段四種樹莓果實(shí)中總酚、總花色苷、花色苷類酚類物質(zhì)、非花色苷類酚類物質(zhì)、超氧化物歧化酶的變化規(guī)律，在四種樹莓果實(shí)成熟過程中，總酚含量和超氧化物歧化酶活性呈下降趨勢，而其總花色苷含量呈上升趨勢；采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀鑒定出9種單體酚類物質(zhì)，分別為矢車菊素3-O-槐糖苷、矢車菊素3-(2''-O-葡萄糖)蕓香苷、矢車菊素3-O-葡萄糖苷、矢車菊素3-O-蕓香苷、天竺葵素3-O-葡萄糖苷、Lambertianin C、地榆素H-6、樹莓酮和鞣花酸；通過對單體酚定量分析發(fā)現(xiàn)，矢車菊素3-O-槐糖苷和矢車菊素3-O-葡萄糖苷是樹莓果實(shí)主要的花色苷類酚類物質(zhì)，Lambertianin C和地榆素H-6是樹莓果實(shí)主要的非花色苷類酚類物質(zhì)。以上研究結(jié)果表明，樹莓果實(shí)的品種和成熟階段對其特征活性物質(zhì)有較大的影響，根據(jù)不同的需求選擇合適的樹莓果實(shí)。本研究為我國中部地區(qū)樹莓果實(shí)的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。