雞蛋葉酸含量檢測方法優(yōu)化及其富集規(guī)律研究

白 彥 王 瑞,2 楊 玉* 李銳瑞 武笑天

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 030801；2.呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，呂梁 033000)

葉酸(folate)是指一類含有蝶酰谷氨酸結(jié)構(gòu)的水溶性維生素，也稱為維生素B9、維生素H等，主要參與體內(nèi)一碳單位代謝，與DNA合成、氨基酸轉(zhuǎn)化、甲酸代謝、組氨酸分解、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成及甲基化反應(yīng)等有關(guān)，是生命體必需物質(zhì)之一[1]。人體內(nèi)沒有葉酸合成相關(guān)酶，需要通過食物或添加劑獲取葉酸。富含葉酸膳食主要有綠色蔬菜、豆類食品、酵母、動(dòng)物肝臟、蛋黃等[2]。雞蛋營養(yǎng)豐富，氨基酸比例適合人體生理需求，是餐桌常見食物。功能性雞蛋主要通過調(diào)節(jié)微量元素、維生素、不飽和脂肪酸等在蛋雞飼糧中的科學(xué)配比進(jìn)行飼喂而得到，其營養(yǎng)價(jià)值高于普通雞蛋。其中，富葉酸雞蛋在我國[3]及加拿大[4]、美國[5]、歐洲[6-7]等地得到廣泛研究和應(yīng)用，但尚未有該產(chǎn)品的國標(biāo)或行標(biāo)來規(guī)范其生產(chǎn)。

雞蛋葉酸含量隨飼糧中葉酸添加量的增加而增加，但并非呈線性增加，而是存在飽和期，達(dá)到飽和期的飼糧葉酸添加量為2～16 mg/kg[3-6]。不同研究人員報(bào)道的雞蛋葉酸含量結(jié)果差異較大，普通雞蛋葉酸含量為17.5～35.0 μg/枚，富葉酸雞蛋為41～75 μg/枚，但總的來講，富葉酸雞蛋中葉酸含量為普通雞蛋的2～3倍[3-4,6,8-10]。這種差異可能與原料類型及來源、蛋雞品種及日齡、檢測方法等有關(guān)。多數(shù)研究持續(xù)時(shí)間為3～14周[3-11]，而蛋雞產(chǎn)蛋周期在50周以上；我國居民消費(fèi)雞蛋多以“個(gè)”為單位，而雞蛋大小對(duì)全蛋葉酸含量有很大影響。因此，需要對(duì)全產(chǎn)蛋期雞蛋葉酸含量進(jìn)行研究。

雞蛋中葉酸的主要形式為5-甲基四氫葉酸(5-methyltetrahydrofolate,5-MTHF)，是人和動(dòng)物體內(nèi)的活性形式，且主要存在于蛋黃，蛋白中幾乎沒有[6,11]。食品中葉酸測定的國標(biāo)法[12]規(guī)定，蛋類樣品葉酸提取采用高壓水解加酶解方法，檢測方法采用微生物法，但整個(gè)檢測過程至少需要5 d時(shí)間。酶解法是利用蛋白酶、淀粉酶等使葉酸從細(xì)胞中釋放出來，隨后利用大鼠血清等將多谷氨酸變成可檢測的單谷氨酸或去谷氨酸形式[13-15]。酶解處理并不是對(duì)所有樣品都適用，還可能會(huì)對(duì)測定結(jié)果有負(fù)面影響[16]。蛋黃中蛋白質(zhì)、脂肪含量較高，超聲處理可降低其粒徑，增大溶解表面積，促進(jìn)其溶解性[17]，是葉酸提取中常用的輔助方法。然而超聲可能對(duì)葉酸結(jié)構(gòu)有一定的破壞[18-19]，需要嚴(yán)格控制時(shí)間。蛋黃葉酸主要與蛋白質(zhì)結(jié)合[20-22]，高溫可以使蛋白質(zhì)變性，從而使葉酸釋放于提取液中[18]，然而高溫可降低葉酸穩(wěn)定性，需添加維生素C等進(jìn)行保護(hù)[3]。微生物檢測法實(shí)驗(yàn)室工作繁雜，標(biāo)準(zhǔn)范圍較窄，重復(fù)性較差，并不能準(zhǔn)確評(píng)估食物中葉酸含量[23]。而高效液相色譜法檢測結(jié)果精確，分析速度快，操作步驟簡單，分離效果理想，逐漸成為主要的檢測手段[13,24]。針對(duì)葉酸檢測，紫外檢測器[24-25]和熒光檢測器[26-29]均有使用，但針對(duì)兩者性能比較的報(bào)道較少。

本試驗(yàn)通過比較熒光檢測器和紫外檢測器的性能，研究超聲、高溫、酶解等提取方法對(duì)蛋黃葉酸含量檢測的影響，旨在優(yōu)化改進(jìn)基于高效液相色譜法測定雞蛋中葉酸含量的方法。通過短期篩選試驗(yàn)，確定生產(chǎn)富葉酸雞蛋飼糧中葉酸的適宜添加量，隨后開展大群飼養(yǎng)的長期穩(wěn)定性試驗(yàn)，確定雞蛋葉酸含量到達(dá)高峰的時(shí)間及穩(wěn)定性，為蛋雞1個(gè)生物學(xué)產(chǎn)蛋年生產(chǎn)穩(wěn)定的富葉酸雞蛋提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5-MTHF(標(biāo)準(zhǔn)品)購自加拿大TRC公司；甲醇(色譜級(jí))購自美國Fisher公司；抗壞血酸(純度99.0%)、巰基乙醇(純度99.0%)、蛋白酶(pepsin，1∶3 000)、大鼠血清購自北京索萊寶科技有限公司；α-淀粉酶購自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；其他用于分離的試劑均為國產(chǎn)分析純；水為4.5 L規(guī)格娃哈哈純凈水。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀配置熒光檢測器和紫外檢測器以及Poroshell 120 EC-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,4 μm)(美國安捷倫科技有限公司)、冷凍干燥機(jī)(美國GOLD-SIM公司)、恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)、超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、冷凍離心機(jī)(鹽城市安信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、組織勻漿儀(IKA T10 basic，德國IKA集團(tuán))、電子天平(BSA224S-CW，德國賽多利斯集團(tuán))。

1.3 高效液相色譜法檢測蛋黃中葉酸方法優(yōu)化

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取10 mg 5-MTHF標(biāo)準(zhǔn)品，用提取液[14](0.1 mol/L 磷酸鹽溶液，含1%抗壞血酸、0.1%巰基乙醇，pH 6.1)溶解后定容到100 mL，配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，-20 ℃保存。將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋到0.10、0.25、0.50、0.75、1.00、5.00、10.00 μg/mL后存于棕色容量瓶中，現(xiàn)配現(xiàn)用，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 高效液相色譜參考條件

柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：20 μL；流速：0.4 mL/min；流動(dòng)相A：甲醇；流動(dòng)相B：pH 4.5、0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液；采用梯度洗脫[27]，如表1所示。熒光檢測條件：激發(fā)波長290 nm，發(fā)射波長360 nm[28]；紫外檢測條件：280、290 nm[25]。

表1 梯度洗脫程序

1.3.3 樣品準(zhǔn)備

檢測體系構(gòu)建使用普通京紅一號(hào)雞蛋的蛋黃凍干粉。具體為：蛋黃分離后，用濾紙小心擦干表面蛋清，混勻，于-80 ℃冰箱凍存1 d后，上機(jī)冷凍干燥48 h(冷阱溫度為-60 ℃，真空度為10 Pa)，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 提取方法優(yōu)化

準(zhǔn)確稱取0.5 g左右同一蛋黃凍干粉樣品于15 mL離心管中，加6 mL提取液，勻漿。之后以超聲、高溫、酶解等方法及其組合進(jìn)行葉酸提取，每個(gè)處理進(jìn)行6次重復(fù)，以選擇適宜提取方法。超聲、高溫、酶解提取的具體方法如下。

超聲提取：40 ℃、80 Hz。

高溫提取：90 ℃水浴5 min后在冰水中冷卻。

酶解提取采用“三酶法”，按文獻(xiàn)[12,15,30]提供的方法，略有改動(dòng)，具體如下：加20 mg/mL蛋白酶溶液1 mL，37 ℃水浴3 h(每隔1 h搖勻1次)，沸水浴10 min后冰水冷卻至室溫，加20 mg/mL淀粉酶溶液1 mL、大鼠血清0.3 mL，37 ℃水浴22 h，沸水浴10 min后冰水冷卻至室溫。

樣品經(jīng)提取處理后，用提取液定容到10 mL，12 000×g、4 ℃離心25 min后取上清液，過0.22 μm濾膜，上機(jī)檢測。整個(gè)過程需要避光操作。

1.3.5 方法驗(yàn)證

從太谷區(qū)某超市購買白殼、粉殼和褐殼雞蛋，烏雞蛋等不同類型雞蛋各10枚，將每枚雞蛋的蛋黃分離后，立即用上述優(yōu)化方法對(duì)新鮮蛋黃中葉酸進(jìn)行檢測。

1.4 葉酸富集規(guī)律試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在太谷區(qū)興民牧業(yè)有限公司進(jìn)行。添加劑葉酸(純度99.8%)為河北某生物科技有限公司生產(chǎn)。

試驗(yàn)雞舍為半封閉式，采用階梯式籠養(yǎng)模式，每籠3只蛋雞，試驗(yàn)期間自由采食和飲水，每日光照16 h，強(qiáng)度不少于15 lx/m2。

1.4.1 適宜添加量篩選試驗(yàn)

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，挑選初始體重一致的健康30周齡京紅一號(hào)蛋雞648只，隨機(jī)分為6組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)18只。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧(表2)，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)飼糧中分別添加1、3、6、12、24 mg/kg葉酸。第5周最后1天每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取10枚雞蛋，將其蛋黃混勻于-80 ℃冰箱保存，進(jìn)行葉酸含量檢測。

表2 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表2項(xiàng)目 Items含量 Content營養(yǎng)水平 Nutrient levels3)代謝能 ME/(MJ/kg)11.08粗蛋白質(zhì) CP16.46粗纖維 CF3.00粗脂肪 EE2.89粗灰分 Ash12.61鈣 Ca3.51總磷 TP0.50有效磷 AP0.22賴氨酸 Lys0.78蛋氨酸 Met0.39蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.66蘇氨酸 Thr0.58葉酸 Folate/(mg/kg)0.35

1.4.2 富葉酸雞蛋葉酸含量的長期穩(wěn)定性研究

根據(jù)1.4.1結(jié)果，選擇16 000羽蛋雞舍，從20周齡起，在蛋雞飼糧中添加7.5 mg/kg葉酸，至60周齡。在雞舍內(nèi)選擇10個(gè)監(jiān)測點(diǎn)，兼顧雞舍上、下，前、后，南、北等。分別于20、21、22、23、24、25、27、29、33、37、41、46、50、55、60周齡09:00—10:00，每個(gè)檢測點(diǎn)取10枚雞蛋，稱重后，分離蛋黃與蛋清，蛋黃稱重混勻后立即進(jìn)行葉酸含量檢測。

1.5 數(shù)據(jù)與分析

數(shù)據(jù)使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法進(jìn)行組間多重比較和差異顯著性分析。方法優(yōu)化數(shù)據(jù)以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，葉酸富集數(shù)據(jù)以平均值和總體標(biāo)準(zhǔn)誤表示?；貧w分析以葉酸添加量為變量，全蛋葉酸含量為因變量，進(jìn)行線性、二次、三次等曲線估算。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。用GraphPad Prism 8進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測器性能比較與選擇

以標(biāo)準(zhǔn)液葉酸含量為橫坐標(biāo)(X)，所對(duì)應(yīng)熒光檢測器、紫外檢測器峰面積(重復(fù)進(jìn)樣3次的平均值)為縱坐標(biāo)(Y)分別進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。將濃度為0.10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.2中的色譜條件測試3次，信噪比為10∶1時(shí)的相應(yīng)濃度為定量限(LOQ)，信噪比為3:1時(shí)的相應(yīng)濃度為檢出限(LOD)。按照1.3.2中色譜條件，連續(xù)10 d，每天檢測1次1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)液，記錄峰面積、峰高、半峰寬，比較檢測器檢測結(jié)果的穩(wěn)定性，如表3所示。結(jié)果顯示，在0～10 μg/mL，熒光檢測器、紫外檢測器280 nm和紫外檢測器290 nm這三者所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.999。熒光檢測器峰面積和峰高均極顯著高于紫外檢測器(P<0.01)，約是紫外檢測器的3.5倍。紫外檢測器在290 nm時(shí)峰面積極顯著高于在280 nm時(shí)(P<0.01)，兩者峰高無顯著性差異(P>0.05)。三者半峰寬無顯著差異(P>0.05)。熒光檢測器的檢出限和定量限遠(yuǎn)低于紫外檢測器，表明其靈敏度更高。后續(xù)試驗(yàn)選用熒光檢測器。

2.2 提取方法對(duì)檢測結(jié)果的影響

由表4可知，樣品勻漿后未進(jìn)行任何處理和采用B提取方法未檢出蛋黃葉酸。只對(duì)C～G提取方法進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：蛋黃葉酸含量檢測值以D提取方法最高，C提取方法次之，再次為E提取方法，F(xiàn)和G提取方法最低。C和D提取方法的檢測值顯著高于F和G提取方法(P<0.05)。后續(xù)試驗(yàn)選用D提取方法，即超聲5 min后90 ℃水浴5 min進(jìn)行蛋黃葉酸提取，隨后及時(shí)檢測。5-MTHF標(biāo)準(zhǔn)品和蛋黃樣品色譜圖如圖1所示。

表3 檢測器性能比較

表4 提取方法對(duì)檢測結(jié)果的影響

圖1 5-MTHF標(biāo)準(zhǔn)品和蛋黃樣品色譜圖

2.3 精密度、回收率和穩(wěn)定性

用2.1和2.2中確定的方法，檢測同一蛋黃凍干粉樣品中葉酸含量，并在樣品中加1 μg 5-MTHF標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行回收率測定，重復(fù)測定8次，結(jié)果如表5所示。樣品回收率平均為98.01%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.42%，同一樣品檢測結(jié)果RSD為2.15%。上述結(jié)果表明優(yōu)化的檢測方法精密度和回收率均能滿足檢測要求。

表5 精密度與回收率試驗(yàn)

由于樣品處理與檢測不能完全同步，隨后進(jìn)行了穩(wěn)定性試驗(yàn)。樣品提取后立即檢測(0 d)以及1、2 d(4 ℃保存)后進(jìn)行檢測，每次3個(gè)重復(fù)。由表6可知，連續(xù)3 d的檢測結(jié)果差異很小，穩(wěn)定性較高。

表6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.4 方法驗(yàn)證

對(duì)市場常見的雞蛋類型蛋黃葉酸含量進(jìn)行檢測，用于驗(yàn)證方法可行性，結(jié)果如表7所示。

2.5 雞蛋中葉酸富集規(guī)律

由表8可知，蛋雞飼糧中添加葉酸1～24 mg/kg可以極顯著提高蛋黃和全蛋葉酸含量(P<0.01)，但并非隨著飼糧葉酸添加量的增加而直線上升，在6～12 mg/kg組達(dá)到最高值后，在24 mg/kg組呈現(xiàn)下降的趨勢。本試驗(yàn)中，葉酸添加量為3～24 mg/kg的4個(gè)組的蛋黃葉酸及全蛋葉酸含量無顯著差異(P>0.05)，但6 mg/kg組全蛋葉酸含量比3 mg/kg組提高8.5%，與12 mg/kg組差異很小，考慮到生產(chǎn)成本問題，需在理論上估測生產(chǎn)富葉酸雞蛋的蛋雞飼糧葉酸適宜添加量。

對(duì)全蛋葉酸含量進(jìn)行回歸分析，結(jié)果如表9所示。結(jié)果顯示，在0～24 mg/kg葉酸添加量范圍內(nèi)，全蛋葉酸含量對(duì)飼糧葉酸添加量的響應(yīng)呈二次和三次曲線變化，且三次曲線的決定系數(shù)高于二次曲線，因此選擇三次曲線的回歸模型計(jì)算雞蛋中葉酸富集量最高時(shí)對(duì)應(yīng)的蛋雞飼糧葉酸添加量，確定7.5 mg/kg為適宜添加量。

表7 常見蛋類葉酸含量

2.6 富葉酸雞蛋在蛋雞產(chǎn)蛋期葉酸含量穩(wěn)定性

從20周齡產(chǎn)蛋開始，在基礎(chǔ)飼糧中添加葉酸7.5 mg/kg，至60周齡，定期檢測雞蛋葉酸含量，測定結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，蛋黃葉酸含量在23周齡趨于穩(wěn)定，在25周齡達(dá)到最高值，在25～60周齡，蛋黃葉酸含量有較小波動(dòng)，且隨著日齡增加，略有下降，但整體保持在5 μg/g以上。全蛋葉酸含量隨著日齡的增加而增加，在33周齡以后，蛋重和蛋黃重增加幅度較小，全蛋葉酸含量基本穩(wěn)定，即每個(gè)雞蛋可提供85 μg以上的葉酸。

表8 飼糧中添加葉酸對(duì)雞蛋葉酸含量的影響

表9 全蛋葉酸含量與飼糧葉酸添加量的回歸模型

圖2 生產(chǎn)周期內(nèi)富葉酸雞蛋蛋重、蛋黃重及葉酸含量

3 討 論

3.1 檢測條件及提取方法的優(yōu)化

葉酸本身具有熒光性[14]，不需要任何衍生方法即可用熒光檢測器進(jìn)行檢測，具備更低的檢測限[16]，干擾峰較少[27]。葉酸在紫外210～300 nm均有吸收，在280[24]和290 nm[25]峰形較好、檢測靈敏度高。本試驗(yàn)中，熒光檢測器在檢出限、定量限、峰型等方面均優(yōu)于紫外檢測器。試驗(yàn)過程中，蛋黃樣品檢測液中葉酸含量在0.125 μg/mL以上，遠(yuǎn)高于熒光檢測器的定量限，滿足檢測要求。

對(duì)蛋黃樣品只進(jìn)行超聲處理時(shí)不能達(dá)到檢出限，表明超聲處理雖然能夠使提取液與樣品更好地接觸，但不能釋放葉酸。本試驗(yàn)中，超聲10 min后高溫提取的檢測結(jié)果低于超聲5 min，表明超聲可能對(duì)葉酸結(jié)構(gòu)有一定的破壞[18-19]，因此需要嚴(yán)格控制超聲時(shí)間。酶解處理也能釋放葉酸，而本試驗(yàn)中酶解處理后的檢測結(jié)果顯著低于高溫處理，可能與樣品中干擾物質(zhì)有關(guān)，使葉酸沒有完全釋放[16]，也可能與處理時(shí)間較長使少量葉酸氧化降解有關(guān)。

Hoey等[6]利用微生物法測得雞蛋中葉酸含量為0.60 μg/g，折合到1個(gè)雞蛋(蛋重50～70 g)為30～40 μg；Jastrebova等[31]利用高效液相色譜法測得蛋黃中葉酸含量為2.26 μg/g，折合到1個(gè)雞蛋(蛋黃重15～20 g)為35～45 μg/枚；梁敏慧[15]利用液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)法測得雞蛋中葉酸含量為0.823 μg/g，折合到1個(gè)雞蛋為41～57 μg；楊艷[3]利用LC-MS法測得雞蛋中葉酸含量約為36 μg/枚。本試驗(yàn)利用優(yōu)化的方法測得不同類型雞蛋中葉酸含量有差異，可能與蛋雞品種、飼糧組成、葉酸添加等有關(guān)，但總體在39～49 μg/枚，與前人研究結(jié)果基本一致，說明方法可行。此方法準(zhǔn)確性高，與國標(biāo)法[12]相比，操作簡單，檢測時(shí)間縮短。

3.2 生產(chǎn)富葉酸雞蛋飼糧葉酸適宜添加量及生產(chǎn)周期內(nèi)雞蛋葉酸含量的穩(wěn)定性

飼糧中添加的葉酸經(jīng)腸道吸收后，在腸上皮細(xì)胞經(jīng)二氫葉酸還原酶的作用轉(zhuǎn)化為四氫葉酸后經(jīng)門靜脈進(jìn)入肝臟，轉(zhuǎn)化為各種形式參與機(jī)體物質(zhì)代謝，其中5-MTHF從肝細(xì)胞進(jìn)入血液后，隨血液循環(huán)到機(jī)體各個(gè)組織器官發(fā)揮重要作用。5-MTHF轉(zhuǎn)運(yùn)至雞卵巢后，經(jīng)胞吞作用進(jìn)入卵黃而達(dá)到富集作用[2]。已有研究顯示，雞蛋中葉酸含量隨著飼糧中葉酸添加量的增加而增加，但到達(dá)一定量后不再增加[3-8,11]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。葉酸在腸道吸收受到限制可能是導(dǎo)致雞蛋中葉酸含量存在平臺(tái)期的一個(gè)因素[32]。不同品種蛋雞對(duì)葉酸的敏感度可能不同。白萊航雞飼糧中添加2 mg/kg葉酸時(shí)，蛋黃葉酸含量達(dá)到飽和[5]；海蘭W36、海蘭W98、海蘭CV20生產(chǎn)富葉酸雞蛋時(shí)，飼糧中葉酸適宜添加量均為4 mg/kg[3-4,33]；海蘭褐蛋雞飼糧中添加16 mg/kg葉酸時(shí)雞蛋葉酸含量最高，且達(dá)到平臺(tái)期[6]。本試驗(yàn)以京紅蛋雞為研究對(duì)象，蛋黃葉酸含量在飼糧葉酸添加量為3 mg/kg時(shí)趨于飽和，在葉酸添加量為6 mg/kg時(shí)達(dá)到最高。但為追求最大生產(chǎn)效益，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果，選擇7.5 mg/kg作為生產(chǎn)富葉酸雞蛋的飼糧葉酸適宜添加量。蛋黃自形成到從卵巢排出需要10 d左右，因而蛋黃中葉酸富集并達(dá)到平衡需要一定時(shí)間。Hoey等[6]研究顯示，飼糧添加葉酸第3周，雞蛋葉酸含量達(dá)到飽和；Dickson等[33]研究表明，蛋雞高峰期(25～28周齡)飼喂添加4 mg/kg葉酸飼糧4周后，全蛋及蛋黃葉酸含量達(dá)到最高值，隨后每8周進(jìn)行1次檢測(共5次)的結(jié)果差異較小，與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。33周齡后每枚雞蛋可提供葉酸85 μg以上，根據(jù)國家衛(wèi)生健康委員會(huì)推薦的居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量[34]計(jì)算，可滿足幼兒至正常成人葉酸推薦量的50%～20%。

4 結(jié) 論

① 基于高效液相色譜法對(duì)葉酸含量進(jìn)行檢測，熒光檢測器性能優(yōu)于紫外檢測器。蛋黃葉酸的提取方法以超聲5 min后90 ℃水浴5 min效果最好。

② 從20周齡起在京紅蛋雞飼糧中添加7.5 mg/kg葉酸，23周齡后蛋黃葉酸含量保持在5 μg/g以上，33～60周齡全蛋葉酸含量保持在85 μg/枚以上。