葉黃素對脂多糖應(yīng)激黃羽肉雞生長性能、空腸形態(tài)和盲腸微生物的影響

王美艷 童玉鑫 閔 遙 王長康 高玉云

(福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/蜂學(xué)學(xué)院，福州 350002)

免疫接種能夠有效幫助機(jī)體對抗特定外來病原體的侵?jǐn)_，是畜禽養(yǎng)殖過程中的重要手段，然而高頻率、大劑量的疫苗接種會使畜禽產(chǎn)生免疫應(yīng)激反應(yīng)。在免疫應(yīng)激狀態(tài)下，一方面家禽的采食量下降，飼糧中營養(yǎng)素重新分配，用于肌肉沉積的營養(yǎng)素轉(zhuǎn)向支持一系列免疫系統(tǒng)的代謝反應(yīng)；另一方面家禽的發(fā)病率和死亡率升高[1]，最終導(dǎo)致養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)損失。因此，建立動(dòng)物免疫應(yīng)激模型，尋找免疫調(diào)節(jié)的營養(yǎng)素具有重要意義。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)又稱內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性菌細(xì)胞外壁的主要成分。研究表明，腹腔注射LPS會引起腸道絨毛萎縮、腸道菌群改變、腸道炎癥、病原體感染及氧化損傷等[2-3]，是目前研究動(dòng)物免疫應(yīng)激的經(jīng)典模型[4-6]。本課題組已經(jīng)建立了LPS肉仔雞免疫應(yīng)激模型(于21、23、25日齡時(shí)連續(xù)3次腹腔注射1 mg/kg LPS)[7]，證實(shí)LPS注射誘導(dǎo)肉仔雞生長性能顯著下降和腸道炎癥應(yīng)答[8]。葉黃素是類胡蘿卜素(carotenoids，Car)的一種，普遍存在于羽衣甘藍(lán)和金盞菊中，具有著色、抗氧化、免疫調(diào)控等多種生物學(xué)功能[9-11]。葉黃素也可以作為免疫調(diào)節(jié)的營養(yǎng)素提高畜禽的生長性能，特別是當(dāng)畜禽處于疾病狀態(tài)或者LPS應(yīng)激引起強(qiáng)烈的急性期反應(yīng)時(shí)[12]。本課題組前期研究表明，葉黃素可以調(diào)控母雞和肉仔雞機(jī)體的免疫應(yīng)答、抗氧化能力、細(xì)胞凋亡、Car代謝相關(guān)基因以及核因子的表達(dá)，但對腸道微生物的作用還不清楚[8,13-16]。家禽的腸道中有一個(gè)復(fù)雜而動(dòng)態(tài)的微生物群落，主要由細(xì)菌組成[17]，對宿主的生長性能和健康狀態(tài)具有重要作用[18-20]。因此，本試驗(yàn)研究不同水平葉黃素對LPS應(yīng)激肉雞生長性能、空腸形態(tài)和盲腸微生物的影響，通過營養(yǎng)調(diào)控手段改善家禽腸道健康，從而為應(yīng)激條件下肉雞的營養(yǎng)調(diào)控及腸道菌群健康提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇體重相近的1日齡健康黃羽肉公雞288只，隨機(jī)分為3個(gè)組，每組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12只雞。對照組(C組)飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加20(L組)和40 mg/kg葉黃素(H組，葉黃素含量為2%，原料組成包括天然葉黃素、稻殼粉、石粉、二氧化硅和乙氧基喹啉)的試驗(yàn)飼糧。全部試驗(yàn)雞于21、23和25日齡時(shí)連續(xù)3次隔天注射1 mg/kg LPS(購自Sigma,貨號L2880)，試驗(yàn)期26 d。試驗(yàn)采用碎米-豆粕型飼糧，參考《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)進(jìn)行配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。紫外分光光度法檢測飼糧中總?cè)~黃素含量(表2)。試驗(yàn)于福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院家禽試驗(yàn)場開展，飼養(yǎng)于封閉式雞舍，采用單層籠養(yǎng)，嚴(yán)格控制舍內(nèi)溫度、光照和通風(fēng)。免疫按照常規(guī)程序操作，試驗(yàn)期間自由飲水。

1.2 樣品采集

飼養(yǎng)結(jié)束后，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)挑選1只雞進(jìn)行屠宰，屠宰前禁食12 h，不禁水。稱重記錄宰前活重，頸部放血處死。打開腹腔，將空腸和盲腸取出，取空腸中段3 cm左右的組織，用生理鹽水將內(nèi)容物沖洗干凈，置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定；將盲腸內(nèi)容物放入2 mL凍存管，液氮凍存后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存待測。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

表2 飼糧中葉黃素的測定值

1.3 檢測指標(biāo)與方法

1.3.1 生長性能

于試驗(yàn)第26天08：00(斷料12 h)，以重復(fù)為單位稱量試驗(yàn)雞宰前活重及余料量，統(tǒng)計(jì)平均日增重、平均日采食量和料重比。試驗(yàn)期間，如果有雞只死亡，則立即稱余料量和死雞重，并記錄數(shù)據(jù)。

平均日增重=(平均終末體重-平均
初始體重)/飼喂天數(shù)；平均日采食量=平均階段采食量/飼喂天數(shù)；料重比=每個(gè)重復(fù)的平均階段采食量/
平均階段增重。

1.3.2 腸道形態(tài)

空腸組織經(jīng)4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定，無水乙醇多稀釋梯度脫水后石蠟包埋，連續(xù)切片、脫蠟、蘇木精-伊紅(HE)染色和封片等，光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察、拍照、分析，并測量絨毛高度、隱窩深度，計(jì)算絨毛高度/隱窩深度(villus height/crypt depth，V/C)。

1.3.3 測序及數(shù)據(jù)分析

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel2019整理后，采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),差異顯著時(shí)使用Duncan氏法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。以P≤0.05表示差異顯著，以P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 葉黃素對LPS應(yīng)激黃羽肉雞生長性能的影響

由表3可知，與C組相比，飼糧中添加40 mg/kg葉黃素可顯著提高LPS應(yīng)激黃羽肉雞22～26日齡和1～26日齡時(shí)的平均日增重(P<0.05)，顯著降低22～26日齡時(shí)的料重比(P<0.05)，但各組間的平均日采食量均無顯著差異(P>0.05)。

2.2 葉黃素對LPS應(yīng)激黃羽肉雞空腸形態(tài)的影響

由圖1和表4可知，與C相比，飼糧中添加20和40 mg/kg葉黃素可顯著提高LPS應(yīng)激黃羽肉雞的空腸絨毛高度(P<0.05)，添加40 mg/kg葉黃素可顯著提高空腸V/C(P<0.05)，但各組間的空腸隱窩深度均無顯著差異(P>0.05)。

2.3 葉黃素對LPS應(yīng)激黃羽肉雞盲腸微生物多樣性的影響

2.3.1 測序數(shù)據(jù)及OTU類

盲腸內(nèi)容物經(jīng)測序、質(zhì)控后有效數(shù)據(jù)量達(dá)65 908，質(zhì)控有效率達(dá)74.01%。以97%的一致性將序列聚類成為OTU，共得到1 154個(gè)OTU。由圖2-A物種稀釋曲線可知，當(dāng)觀測到的物種(observed species)稀釋曲線的測序條數(shù)達(dá)到60 000時(shí)，曲線趨向平坦；由表5可知，覆蓋率(goods coverage)均為0.99。這說明測序數(shù)據(jù)合理，測序深度足夠，可以反映樣品中絕大多數(shù)微生物信息。

將所有樣品的OTU個(gè)數(shù)進(jìn)行韋恩(Venn)分析，從而反映樣本組間共有和特有的OTU情況。由圖2-B OTU韋恩圖可知，3組中共有304個(gè)核心OTU，占所有OTU的26.34%。C、L和H組分別特有104、119和122個(gè)OTU，同時(shí)L和H組共有250個(gè)OTU。

表4 葉黃素對LPS應(yīng)激黃羽肉雞空腸形態(tài)的影響

圖1 葉黃素對LPS應(yīng)激黃羽肉雞空腸組織HE染色切片的影響

2.3.2 Alpha多樣性分析

由表5可知，與C相比，飼糧中添加20和40 mg/kg葉黃素可顯著提高LPS應(yīng)激黃羽肉雞盲腸微生物的Shannon指數(shù)(P<0.05)；但各組間盲腸微生物Chao1指數(shù)差異不顯著(P>0.05)。

2.3.3 Beta多樣性分析

在主坐標(biāo)分析(PCoA)中，樣本距離越接近，表示物種組成結(jié)構(gòu)越相似，由圖3可知，C組樣本集中聚集在右側(cè)，而L和H組樣本部分重疊并集中聚集在左側(cè)。多響應(yīng)置換過程(MRPP)分析法用于分析組間微生物群落結(jié)構(gòu)的差異，配合PCoA降維圖使用。由表6可知，3組的組間差異均大于組內(nèi)差異(A值>0)；C組和H組組間差異最大(期望增量=0.41)，L組和H組組間差異最小(期望增量=0.37)；C組和L組及C組和H組組間差異顯著(顯著性值<0.05),L組和H組組間差異不顯著(顯著性值>0.10)。

C: 對照組; L: 20 mg/kg葉黃素組; H: 40 mg/kg葉黃素組。下圖同。

表5 葉黃素對LPS應(yīng)激黃羽肉雞盲腸微生物Alpha多樣性的影響

圖3 基于加權(quán)Unifrac距離的主坐標(biāo)分析

2.3.4 門水平和屬水平相對豐度分析

由圖4-A可知，盲腸微生物注釋了10個(gè)菌門，其中厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為優(yōu)勢菌門，占微生物總數(shù)的97.61%。由表7可知，飼糧中添加20和40 mg/kg葉黃素黃羽肉雞盲腸微生物厚壁菌門相對豐度顯著高于C組(P<0.05)，但變形菌門相對豐度顯著低于C組(P<0.05)；添加40 mg/kg葉黃素?cái)M桿菌門相對豐度最高。圖4-B展示了屬水平相對豐度前10的微生物，共占比59.68%。由表7可知，C組中未鑒定的腸桿菌科(unidentified Enterobacteriaceae)相對豐度顯著高于其他2組(P<0.05)，擬桿菌屬(Bacteroides)相對豐度升高(P>0.10)；飼糧中添加20和40 mg/kg葉黃素艾森伯格菌屬(Eisenbergiella)相對豐度顯著高于C組(P<0.05)，布勞特氏菌屬(Blautia)和腔隙桿菌屬(Lachnoclostridium)相對豐度升高(P>0.10)；添加40 mg/kg葉黃素普氏梭桿菌屬(Flavonifractor)相對豐度顯著高于C組(P<0.05)。

表6 MRPP組間差異分析

Firmicutes: 厚壁菌門; Proteobacteria: 變形菌門; Bacteroidetes: 擬桿菌門; Actinobacteria: 放線菌門；Cyanobacteria: 藍(lán)藻門; Unidentified_Bacteria: 未鑒定的細(xì)菌; Acidobacteria: 酸桿菌門; Spirochaetes: 螺旋體門; Verrucomicrobia: 疣微菌門; Armatimonadetes: 裝甲菌門; Others: 其他; Unidentified_Enterobacteriaceae: 未鑒定的腸桿菌科; Bacteroides: 擬桿菌屬; Enterococcus: 腸球菌屬; Unidentified_Lachnospiraceae: 未鑒定的毛螺菌科; Eisenbergiella: 艾森伯格菌屬; Unidentified_Ruminococcaceae: 未鑒定的瘤胃菌科; Butyricicoccus: 丁球菌屬; Bifidobacterium: 雙歧桿菌屬; Flavonifractor: 普氏梭桿菌; Alistipes: 另枝菌屬。

表7 葉黃素對LPS應(yīng)激黃羽肉雞盲腸微生物優(yōu)勢門和優(yōu)勢屬相對豐度的影響

續(xù)表7微生物分類 Taxa of microorganism葉黃素添加水平 Lutein supplemental levels/(mg/kg)02040腸球菌屬 Enterococcus5.69±5.387.71±6.244.12±3.06未鑒定的毛螺菌科 Unidentified Lachnospiraceae8.11±4.139.30±3.256.39±2.21艾森伯格菌屬 Eisenbergiella3.16±2.61b7.81±1.89a8.04±2.26a未鑒定的瘤胃菌科 Unidentified Ruminococcaceae1.99±1.023.59±2.413.52±1.52丁球菌屬 Butyricicoccus2.68±1.473.75±2.084.11±1.69雙歧桿菌屬 Bifidobacterium1.81±1.181.00±1.211.48±2.58普氏梭桿菌 Flavonifractor0.98±0.47b2.09±0.99ab2.62±1.43a另枝菌屬 Alistipes0.12±0.180.40±0.930.97±1.83布勞特氏菌屬 Blautia0.43±0.291.07±0.671.07±1.58腔隙桿菌 Lachnoclostridium1.82±0.432.82±1.212.80±0.88

2.3.5 組間差異物種和功能預(yù)測

利用線性判別分析效應(yīng)(LEfSe)分析并通過線性判別分析(LDA)實(shí)現(xiàn)降維，從而評估差異物種的影響大小，最后繪制差異物種圖。由圖5可知，3組間LDA值>4的生物標(biāo)志物共有14個(gè)，包括C組變形菌門、L組厚壁菌門和H組艾森伯格菌屬等。由圖6可知，為了進(jìn)一步了解微生物組代謝的情況，采用Tax4Fun法對盲腸微生物進(jìn)行功能預(yù)測，發(fā)現(xiàn)與氨基酸代謝、碳水化合物代謝及遺傳信息有關(guān)的KEGG通路在L和H組中顯著富集(P<0.05)。

圖5 盲腸微生物L(fēng)EfSe分析

3 討 論

3.1 葉黃素對LPS應(yīng)激肉雞生長性能的影響

目前，關(guān)于葉黃素對肉雞生長性能的報(bào)道結(jié)果并不完善。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加20和40 mg/kg葉黃素對LPS應(yīng)激前(1～21日齡)肉雞的促生長效果不顯著。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是葉黃素對正常生理狀態(tài)下肉雞的生長性能沒有顯著影響。這一結(jié)果與李麗平等[21]和阿侖[22]的研究結(jié)果基本一致，但Moraes等[23]發(fā)現(xiàn)飼糧中添加50 mg/kg葉黃素和1%共軛亞油酸時(shí)能顯著提高1～20日齡肉雞的體增重和料重比，緩解共軛亞油酸對肉雞生長的抑制作用，說明葉黃素對特定條件下肉雞的生長性能有促進(jìn)作用。郭俊杰等[24]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加2 g/kg常規(guī)葉黃素可顯著提高高溫條件[(33.00±0.52)℃]下60～88日齡黃羽肉雞的末重和平均日采食量，促進(jìn)肉雞的生長性能，這與王文龍等[25]和安立龍等[26]的報(bào)道基本一致。免疫接種和飼養(yǎng)管理不當(dāng)?shù)榷紩T導(dǎo)肉雞發(fā)生免疫應(yīng)激反應(yīng)，從而影響肉雞的生長性能。本課題組中，張杰[7]研究發(fā)現(xiàn)，于肉雞21、23和25日齡時(shí)連續(xù)3次隔天注射1 mg/kg LPS，能顯著降低肉雞的平均日增重和體增重；而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加40 mg/kg葉黃素能顯著提高應(yīng)激階段(22～26日齡)和整個(gè)試驗(yàn)期(1～26日齡)肉雞的平均日增重，緩解由于LPS應(yīng)激造成肉雞生長性能的下降。這可能與葉黃素具有抗氧化和抗炎特性[24-25]，能緩解LPS應(yīng)激下肉雞的炎癥反應(yīng)有關(guān)。因此，飼糧中添加40 mg/kg葉黃素可以緩解LPS應(yīng)激下肉雞生長性能下降的影響。

圖6 基于KEGG通路分析預(yù)測元基因組功能

3.2 葉黃素對LPS應(yīng)激肉雞腸道形態(tài)的影響

小腸是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場所，絨毛高度增加和隱窩深度變淺可以為營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收提供更大的表面積[26]。Kamboh等[27]研究表明，飼糧中添加金雀異黃素和橙皮苷可以提高LPS應(yīng)激肉雞的腸道絨毛高度和V/C。張子琪等[28]研究表明，蝦青素和LPS組可以改善小鼠的空腸形態(tài)。Csernus等[29]對26日齡肉雞腹腔注射2 mg/kg LPS，發(fā)現(xiàn)添加Car可以提高V/C，并顯著提高絨毛高度，促進(jìn)回腸營養(yǎng)物質(zhì)吸收。以上研究結(jié)果表明，在LPS應(yīng)激條件下，飼糧中添加Car可以改善肉雞腸道形態(tài)和促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收。本試驗(yàn)結(jié)果中，飼糧中添加40 mg/kg葉黃素可以顯著提高LPS應(yīng)激肉雞的空腸絨毛高度和V/C，說明LPS應(yīng)激條件下飼糧中添加葉黃素可以改善空腸形態(tài)，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收。

3.3 葉黃素對LPS應(yīng)激肉雞盲腸微生物多樣性的影響

家禽的胃腸道是細(xì)菌豐富度和多樣性最高的區(qū)域[30]，其中盲腸是尿素循環(huán)、水分調(diào)節(jié)和碳水化合物發(fā)酵的重要場所，對肉雞的腸道營養(yǎng)和健康起著重要作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加20和40 mg/kg葉黃素可顯著提高LPS應(yīng)激肉雞盲腸微生物的Shannon指數(shù)，說明飼糧中添加葉黃素可以提高LPS應(yīng)激肉雞盲腸微生物的多樣性。通過PCoA分析可知20和40 mg/kg葉黃素組LPS應(yīng)激肉雞盲腸微生物結(jié)構(gòu)相似，但與C組距離較遠(yuǎn)，說明飼糧中添加葉黃素可以改變LPS應(yīng)激肉雞盲腸微生物的結(jié)構(gòu)和組成。

Wei等[31]對家禽腸道微生物研究發(fā)現(xiàn)，肉雞盲腸中最常見的菌門是厚壁菌門(70%)、擬桿菌門(12%)和變形菌門(9%)。厚壁菌門與纖維分解、碳水化合物代謝有關(guān)[32]；擬桿菌門能夠降解非纖維性碳水化合物、蛋白質(zhì)，促進(jìn)胃腸道免疫系統(tǒng)發(fā)育[33-34]；變形菌門包括大量的革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌，它們通過細(xì)胞壁上的LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[35]。此外，變形桿菌與慢性腸炎的聯(lián)系已在小鼠模型上得到證實(shí)[36]。本試驗(yàn)中，LPS應(yīng)激肉雞盲腸微生物中厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門為主要優(yōu)勢菌門，飼糧中添加20和40 mg/kg葉黃素后厚壁菌門的相對豐度約為70%，顯著高于C組；變形菌門相對豐度約為10%，顯著低于C組。這說明LPS應(yīng)激對盲腸微生物優(yōu)勢菌門組成沒有造成顯著影響，但是會改變優(yōu)勢菌門的相對豐度，而添加20和40 mg/kg葉黃素后能改善門水平微生物的相對豐度。飼糧中添加40 mg/kg葉黃素厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度最大，盲腸中消化代謝淀粉類碳水化合物有關(guān)細(xì)菌以及飼糧中攝取的能量也相對最多。飼糧中添加葉黃素能減少LPS應(yīng)激肉雞盲腸中變形菌門和未鑒定的腸桿菌科的相對豐度，在一定程度上能預(yù)防家禽呼吸道疾病的發(fā)生。本試驗(yàn)中，LPS應(yīng)激肉雞盲腸微生物的優(yōu)勢菌屬為未鑒定的腸桿菌科和擬桿菌屬。與Wei等[31]的結(jié)果不一致，這可能與LPS應(yīng)激誘導(dǎo)肉雞盲腸微生物菌群改變有關(guān)。厚壁菌門下的普氏梭桿菌屬，有助于丁酸鹽的產(chǎn)生[37]，丁酸鹽有利于提高飼料轉(zhuǎn)化率和生長性能[38]。本試驗(yàn)中，LPS應(yīng)激肉雞后，飼糧中添加40 mg/kg葉黃素普氏梭桿菌屬相對豐度顯著高于C組，說明添加40 mg/kg葉黃素可能會促進(jìn)LPS應(yīng)激肉雞的生長性能。布勞特氏菌屬是一種革蘭氏陽性菌，能降解不同類型的碳水化合物，產(chǎn)生乙酸、乳酸等代謝產(chǎn)物，為機(jī)體提供能量，減少炎癥[39]。本試驗(yàn)中，飼糧中添加20和40 mg/kg葉黃素布勞特氏菌屬相對豐度高于C組，說明葉黃素能在一定程度上改善LPS應(yīng)激肉雞的盲腸腸道健康。研究發(fā)現(xiàn)，肉雞盲腸微生物中與氨基酸、碳水化合物代謝相關(guān)的KEGG通路始終大量存在，這與肉雞腸道健康密切相關(guān)[40-41]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，各組間KEGG通路表現(xiàn)出差異性富集，其中飼糧中添加20和40 mg/kg葉黃素與氨基酸、碳水化合物代謝相關(guān)功能顯著富集。因此，飼糧中添加20和40 mg/kg葉黃素均能平衡盲腸菌群結(jié)構(gòu)，緩解免疫應(yīng)激誘導(dǎo)的盲腸微生物屏障功能損傷。

4 結(jié) 論

飼糧中添加20和40 mg/kg葉黃素能改善LPS應(yīng)激黃羽肉雞空腸形態(tài)和盲腸微生物的結(jié)構(gòu)組成，提高厚壁菌門和艾森伯格菌屬相對豐度，降低變形菌門和未鑒定的腸桿菌科相對豐度；與氨基酸代謝、碳水化合物代謝和遺傳信息相關(guān)的KEGG通路在20和40 mg/kg葉黃素組中顯著富集。在本試驗(yàn)條件下，飼糧中添加40 mg/kg葉黃素時(shí)效果最佳，能顯著提高LPS應(yīng)激黃羽肉雞的生長性能。