浮萍對(duì)Cu2+脅迫的反應(yīng)機(jī)理研究

韓雪靜亞

（南京師范大學(xué)中北學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212300）

重金屬在水體中不能被微生物降解，只能以不同的價(jià)態(tài)在水和生物之間轉(zhuǎn)移，當(dāng)在水體中積累到一定的濃度時(shí)，就會(huì)對(duì)水生動(dòng)植物系統(tǒng)造成嚴(yán)重危害。銅是植物生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)元素，在生物體內(nèi)，多以銅離子或銅蛋白形式存在，在植物葉片中，葉綠體內(nèi)的銅含量最高。銅是一種廣泛存在于水體中的過(guò)渡金屬，雖然濃度不高，但由于其毒性效應(yīng)明顯，受到了環(huán)境科學(xué)界的廣泛關(guān)注。因此，本研究以Cu2+為脅迫因子，以浮萍為材料，研究了不同質(zhì)量濃度Cu2+對(duì)葉綠素含量、可溶性蛋白含量、丙二醛濃度和保護(hù)酶活性的影響，揭示Cu2+對(duì)水生植物的毒害機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

浮萍（Lemna minorL.）是浮萍科浮萍屬漂浮植物。實(shí)驗(yàn)材料采自南京水域，后移植于南京師范大學(xué)中北學(xué)院實(shí)驗(yàn)室塑料盆中培養(yǎng)。

1.2 材料的培養(yǎng)

2020年10月初，將實(shí)驗(yàn)材料置于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的塑料盆中，用自來(lái)水馴化5天。選取生長(zhǎng)狀況較為一致的植株，分別用含有質(zhì)量濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.5 mg/L的Cu2+（以無(wú)水硫酸銅配制，質(zhì)量濃度以純Cu2+計(jì)算）的1/10Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液處理。第5天取相同部位的葉片，用去離子水洗凈擦干，測(cè)定其生理生化指標(biāo)。

1.3 生理生化指標(biāo)

葉綠素含量采用丙酮法測(cè)定，可溶性蛋白含量選用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定，MDA濃度按照硫代巴比妥酸的方法測(cè)定，SOD活性選擇NBT光化學(xué)還原法測(cè)定。POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法。

1.3.1 葉綠素含量的測(cè)定

采取丙酮法，將葉片用80%的丙酮研磨成勻漿，用漏斗過(guò)濾，分別在652、663和645 nm處測(cè)定吸光度。

1.3.2 可溶性蛋白含量的測(cè)定

選用考馬斯亮藍(lán)G-2 5 0法測(cè)定，以牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。在595 nm處測(cè)定吸光度。

1.3.3 丙二醛（MDA）含量的測(cè)定

葉片膜脂質(zhì)過(guò)氧化的程度用丙二醛（MDA）的含量來(lái)表示。MDA含量用硫代巴比妥酸（TBA）比色法測(cè)定。

1.3.4 超氧化物歧化酶（SOD）活性的測(cè)定

取鮮重0.5 g的葉片，加入5 mL濃度為50 mmoL/L的磷酸緩沖溶液，在冰浴下研磨成勻漿并離心，上清液用于酶活性分析。

1.3.5 過(guò)氧化物酶（POD）活性的測(cè)定

參照愈創(chuàng)木酚法，在470 nm處每隔10 s讀一次數(shù)。以每分鐘吸光度的變化值表示酶活性大小。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。將各生理生化指標(biāo)與處理濃度作相關(guān)性分析（相關(guān)系數(shù)為r），處理組與對(duì)照組之間的差異顯著性分析由SPSS統(tǒng)計(jì)軟件完成，其中，P＜0.05和P＜0.01分別表示顯著差異和極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cu2+對(duì)浮萍葉片總?cè)~綠素含量的影響

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，浮萍葉片葉綠素含量隨著Cu2+質(zhì)量濃度的升高而下降。在Cu2+質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時(shí)，葉綠素含量下降了65.93%，葉綠素a/b含量達(dá)到了最低值，尤其是葉綠素a的含量急劇降低。

2.2 Cu2+對(duì)浮萍葉片可溶性蛋白含量的影響

隨著Cu2+質(zhì)量濃度的升高，浮萍葉片可溶性蛋白含量逐漸下降。其中，在Cu2+質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時(shí)，可溶性蛋白含量略微降低。當(dāng)Cu2+質(zhì)量濃度超過(guò)1.5 mg/L時(shí)，浮萍中的可溶性蛋白含量顯著下降。統(tǒng)計(jì)分析表明，可溶性蛋白含量與Cu2+質(zhì)量濃度之間達(dá)到了極顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.933 6，P＜0.01）。

2.3 Cu2+對(duì)浮萍葉片丙二醛（MDA）濃度的影響

MDA濃度隨Cu2+質(zhì)量濃度的變化如圖1所示，隨著Cu2+質(zhì)量濃度的不斷升高，MDA的濃度也不斷增加。在Cu2+質(zhì)量濃度為2.5 mg/L時(shí)，浮萍葉片的MDA濃度達(dá)到最高。統(tǒng)計(jì)分析表明，MDA的濃度與Cu2+質(zhì)量濃度呈極顯著正相關(guān)（r=0.971 0，P＜0.01）。

圖1 Cu2+質(zhì)量濃度對(duì)浮萍葉片丙二醛（MDA）濃度的影響

2.4 Cu2+對(duì)浮萍葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

SOD活性隨Cu2+質(zhì)量濃度的變化如圖2所示，隨著Cu2+質(zhì)量濃度的增加，SOD活性先上升后下降，在Cu2+質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時(shí)達(dá)到最大值。統(tǒng)計(jì)分析表明，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組之間的SOD值達(dá)到了極顯著差異（P＜0.01）。

圖2 Cu2+質(zhì)量濃度對(duì)浮萍葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

2.5 Cu2+對(duì)浮萍葉片過(guò)氧化物酶（POD）活性的影響

隨著Cu2+質(zhì)量濃度的不斷升高，POD活性也呈先上升后下降的趨勢(shì)，在Cu2+質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時(shí)達(dá)到峰值，比對(duì)照組上升了63.79%。

3 討論

葉綠素是植物光合作用的主要色素，其含量與植物光合作用水平有著密切的關(guān)系。銅參與光合作用的電子傳遞和光合磷酸化及多種葉綠體酶的合成，對(duì)植物葉綠體含量和光合作用有著直接影響[1]。本實(shí)驗(yàn)采用2.5 mg/L Cu2+處理時(shí)，葉綠素含量降到最低。

可溶性蛋白質(zhì)的含量能反映植物生理活動(dòng)的旺盛程度。研究發(fā)現(xiàn)，在不同質(zhì)量濃度的Cu2+處理下，浮萍葉片的可溶性蛋白含量逐漸降低，在低質(zhì)量濃度Cu2+（0.5 mg/L）下下降緩慢；在高質(zhì)量濃度Cu2+（≥1.5 mg/L）下下降明顯。這可能是因?yàn)镃u2+在細(xì)胞內(nèi)提高了蛋白水解酶的活性，加快了蛋白質(zhì)的水解[2]。

丙二醛是最常見(jiàn)的膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物，從膜上產(chǎn)生的位置釋放后，可以與蛋白質(zhì)等生物大分子發(fā)生反應(yīng)，從而改變生物大分子的結(jié)構(gòu)，甚至使其喪失功能。浮萍中MDA濃度隨著Cu2+質(zhì)量濃度的上升而增加，說(shuō)明膜脂過(guò)氧化程度加劇。

超氧化物歧化酶普遍存在于植物體內(nèi)，是一種清除超氧陰離子自由基的酶，其與過(guò)氧化物酶協(xié)同作用并預(yù)防活性氧或其他過(guò)氧化物自由基對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)造成傷害。Cu2+脅迫可打破三者的平衡，使植物體內(nèi)自由基含量上升。SOD和POD的活性都是先升后降，其活性的降低在一定程度上加劇了活性氧對(duì)膜的傷害，導(dǎo)致植物細(xì)胞損傷過(guò)大，保護(hù)能力下降，細(xì)胞結(jié)構(gòu)及生理生化反應(yīng)被破壞，最終加速了植物細(xì)胞的衰老和死亡[3]。

重金屬Cu2+對(duì)浮萍有明顯的毒害作用，會(huì)破壞植物正常的生理代謝，最終導(dǎo)致植物死亡。