MIL-101-NH2介導(dǎo)的核酸分子遞送與基因沉默研究

艾一純，袁雪嬌，余益成，呂 敏，陳 楠

（上海師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，上海200234）

0 引言

核酸（DNA和RNA）在臨床上能否發(fā)揮最大功效一定程度上取決于核酸載體［1］.病毒作為早期核酸載體，其作用機(jī)理是通過(guò)包裝遺傳物質(zhì)，保護(hù)它們不受核酸酶的影響，并將它們載運(yùn)到具有高度特異性的靶細(xì)胞中.截至2017年，約67%的基因治療臨床試驗(yàn)是由病毒載體完成的［2］.然而，使用病毒作為基因載體仍然存在一些問(wèn)題，包括免疫原性、插入性突變以及病毒本身的安全性等［3］.此外，病毒傳遞基因能力有限，大規(guī)模生產(chǎn)所需成本高，阻礙了其在實(shí)際的廣泛應(yīng)用.因此，新型基因載體——非病毒載體的研發(fā)和應(yīng)用成為了當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域核酸應(yīng)用方向的前沿焦點(diǎn)［4-5］.

納米載體，包括脂質(zhì)體［6］、膠束［7］、樹狀大分子［8］、介孔二氧化硅納米顆粒［9］、金納米粒子［10］、超順磁性氧化鐵納米粒子［11］、碳納米管［12］和量子點(diǎn)［13］等，用于生物分子傳遞的研究被大量報(bào)道.近年來(lái)，金屬-有機(jī)框架（MOF）由于其具有高度有序的孔隙和固有孔徑、較大的比表面積以及能夠進(jìn)行有效的表面修飾，受到越來(lái)越多的關(guān)注，已成為納米載體中的新貴，并被廣泛應(yīng)用于藥物和基因等的載運(yùn)［14-15］.例如，有研究組采用PCN-224納米MOF負(fù)載光敏劑卟啉制成超小MOF量子點(diǎn).在650 nm激光照射下，MOF量子點(diǎn)能產(chǎn)生2倍的活性氧（ROS），大大提高了光動(dòng)力學(xué)治療（PDT）的效率［16］.基于這些特點(diǎn)，納米MOF也可以作為一種有效的納米載體來(lái)傳遞核酸分子.

本工作利用熱溶劑法快速合成單分散的鐵基MIL-101-NH2納米MOF［17］.MIL-101-NH2具有較低的細(xì)胞毒性.如圖1所示，通過(guò)靜電作用［18］，將單鏈DNA和siRNA核酸分子（NA）分別負(fù)載到MIL-101-NH2納米粒子上，制備了MIL-101-NH2-NA，并對(duì)其細(xì)胞學(xué)行為進(jìn)行考察.熒光成像表明：MIL-101-NH2-NA能有效進(jìn)入細(xì)胞，且能夠?qū)崿F(xiàn)溶酶體逃逸.在生理?xiàng)l件下，MIL-101-NH2-NA能降解釋放siRNA，有效發(fā)揮基因沉默效應(yīng).總之，MIL-101-NH2作為一種有效的納米遞送系統(tǒng)，為核酸運(yùn)載和應(yīng)用提供了新策略.

圖1 MIL-101-NH2-NA的合成以及體內(nèi)基因沉默示意圖

1 材料與方法

1.1 材料

六水合三氯化鐵（FeCl3·6H2O）、2-氨基對(duì)苯二甲酸和N，N-二甲基甲酰胺（DMF），購(gòu)自上海探索平臺(tái)；3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯四唑溴化銨（MTT）和遺傳霉素（Geneticin，G418），購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；最小必需培養(yǎng)基（MEM）和胎牛血清（FBS），購(gòu)自Gibco Invitrogen公司；瓊脂糖、總RNA抽提試劑（Trizol試劑）和細(xì)胞核染料（Hoechst 33342），購(gòu)自碧云天公司；溶酶體染料（lysotracker green），購(gòu)自Life Technology公司；上樣緩沖液（6×loading buffer）和反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT Reagent Kit），購(gòu)自TakaRa公司；凝膠電泳緩沖液（50×TAE buffer）、焦碳酸二乙酯處理過(guò)的水（DEPC水）和DNA-Cy3（5’Cy3-TGGACACTCGGAATG-3’），購(gòu)自上海生工公司；EGFP siRNA（sense：5’-GCAUCAAGGUGAACUUC AAGA-3’和antisense：5’-UUGAAGUUCACCUUGAUGCCG-3’），購(gòu)自上海吉瑪公司；超純水用Aquapro系統(tǒng)（18 MΩ·cm）制備.

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（FESEM），Hitachi S-4800；動(dòng)態(tài)光散射（DLS）分析儀，Malvern Nano-ZS 90；超速離心機(jī)，Beckman Coulter DU 730；酶標(biāo)儀，Thermo Multiskan MK 3；激光掃描共聚焦顯微鏡（CLSM），Leica TCS SP 8；離心機(jī)，Eppendorf Centrifuge 5424 R；超聲機(jī)，XM 300 UHP；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，Thermo Scientific BB150；NanoDrop分光光度計(jì)，Thermo Scientific ND-ONEC-W；聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）核酸擴(kuò)增儀，東勝龍ETC 811；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，ABI Quant Studio 3.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MIL-101-NH2的制備

將FeCl3·6H2O（0.675 g）與2-氨基對(duì)苯二甲酸（0.225 g）混合在15 mL DMF中，充分?jǐn)嚢韬笾糜?0 mL不銹鋼高壓釜內(nèi)，110℃熱處理24 h.冷卻至室溫后，離心（4 500 r·min-1，15 min）分離所得顆粒，用DMF和乙醇交替洗滌3次，干燥得到MIL-101-NH2棕黑色固體.

1.3.2 MIL-101-NH2-NA的制備

分散于DEPC水中的MIL-101-NH2（200μL，200μg·mL-1）與NA（10μL，20μmol·L-1）混合，質(zhì)量比為m（MIL-101-NH2）∶m（NA）=16∶1，室溫條件下以轉(zhuǎn)速600 r·min-1混勻30 min.然后，離心（10 000 r·min-1，10 min）去除上清，DEPC水重新分散固體得到MIL-101-NH2-NA.

1.3.3 MIL-101-NH2和MIL-101-NH2-NA的表征

用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（FESEM）表征MIL-101-NH2的形貌及粒徑，DLS分析儀表征MIL-101-NH2和MIL-101-NH2-NA的水分散性和Zeta電位.

1.3.4 瓊脂糖電泳

MIL-101-NH2-NA（10μL，20μg·mL-1）、NA（10μL，100 nmol·L-1）分別與6×loading buffer（2μL）混合制備瓊脂糖電泳樣品.稱取1 g瓊脂糖溶于50 mL 1×TAE buffer中，加熱溶解，加入5μL凝膠紅（GelRed）核酸染料制備質(zhì)量濃度為0.02 g·mL-1的瓊脂糖凝膠.在電壓100 V條件下，電泳30 min后分析NA條帶.通過(guò)NA的物質(zhì)的量和MIL-101-NH2的質(zhì)量之比，計(jì)算出NA的負(fù)載率，單位為nmol·mg-1.

1.3.5 Hela-EGFP細(xì)胞培養(yǎng)

Hela-EGFP細(xì)胞用含有體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS、100 units·mL-1青霉素、100 units·mL-1鏈霉素和500μg·mL-1G418的MEM培養(yǎng)液培養(yǎng).Hela細(xì)胞用含有10%FBS、100 units·mL-1青霉素、100 units·mL-1鏈霉素的MEM培養(yǎng)液培養(yǎng).細(xì)胞在含有體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行所有的實(shí)驗(yàn).

1.3.6 細(xì)胞活力檢測(cè)

用MTT分析法評(píng)價(jià)MIL-101-NH2納米材料對(duì)Hela-EGFP細(xì)胞活力的影響.細(xì)胞接種于96孔板（每孔5 000個(gè)細(xì)胞），過(guò)夜培養(yǎng).用100μL不同質(zhì)量濃度的MIL-101-NH2（20，50，100μg·mL-1）新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng).孵育24 h后，PBS洗2次，加入MTT溶液（100μL，0.5 mg·mL-1），在37℃孵育4 h.然后，去除MTT溶液，加入DMSO（100μL），37℃孵育20 min.最后，用酶標(biāo)儀測(cè)試490 nm處的吸光度，X表示細(xì)胞活力，Y表示吸光度值：

1.3.7 熒光成像

使用CLSM研究MIL-101-NH2的細(xì)胞攝取.在直徑為35 mm的玻璃底培養(yǎng)皿中接種Hela細(xì)胞（每個(gè)培養(yǎng)皿含3×104個(gè)細(xì)胞），過(guò)夜培養(yǎng).分別用含有10μg·mL-1和20μg·mL-1的MIL-DNA-Cy3培育細(xì)胞，孵育24 h后，用PBS沖洗細(xì)胞3次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定，然后用Hoechst 33342對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，最后用CLSM進(jìn)行熒光成像.

使用CLSM研究核酸的溶酶體逃逸.在直徑為35 mm的玻璃底培養(yǎng)皿中接種Hela細(xì)胞（每個(gè)培養(yǎng)皿含3×104個(gè)細(xì)胞），過(guò)夜培養(yǎng).MIL-DNA-Cy3與細(xì)胞共培養(yǎng)，分別孵育8 h和16 h后，PBS沖洗細(xì)胞，用lysotracker green對(duì)溶酶體進(jìn)行活細(xì)胞熒光染色，最后用CLSM進(jìn)行熒光成像.

使用CLSM研究綠色熒光蛋白（EGFP）的敲除效應(yīng).在直徑為35 mm的玻璃底培養(yǎng)皿中接種Hela-EGFP細(xì)胞（每個(gè)培養(yǎng)皿含3×104個(gè)細(xì)胞），過(guò)夜培養(yǎng).分別用EGFP siRNA（siEGFP），lipo 3000（轉(zhuǎn)染試劑）轉(zhuǎn)染siEGFP和MIL-si EGFP培育細(xì)胞.孵育48 h后，PBS沖洗細(xì)胞3次，4%多聚甲醛固定，然后用Hoechst 33342對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，最后用CLSM進(jìn)行熒光成像.

1.3.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）

為了確定EGFP的表達(dá)程度，采用RT-qPCR對(duì)EGFP mRNA進(jìn)行定量分析.6孔板接種Hela-EGFP細(xì)胞（每孔15×104個(gè)細(xì)胞），過(guò)夜培養(yǎng).分別用EGFP siRNA，lipo 3000轉(zhuǎn)染siEGFP和MIL-siEGFP培育細(xì)胞.孵育48 h后，細(xì)胞用PBS洗滌2次.采用Trizol法提取總RNA，每個(gè)樣品取1μL，用NanoDrop分光光度計(jì)測(cè)定RNA的質(zhì)量濃度.將提取的RNA樣品稀釋至相同質(zhì)量濃度（200μg·mL-1），然后用PrimeScript RT Reagent Kit從RNA逆轉(zhuǎn)錄到cDNA.采用SYBR Green Reagents染料法在ABI Quant Studio 3 PCR系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)分析樣品.

2 結(jié)果與討論

2.1 MIL-101-NH2-NA的合成及表征

以Fe3+作為金屬離子結(jié)點(diǎn)，2-氨基對(duì)苯二甲酸作為有機(jī)配體，用熱溶劑法合成了MIL-101-NH2，如圖1所示.通過(guò)場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（FESEM）對(duì)MIL-101-NH2進(jìn)行了形貌表征，如圖2（a）所示，MIL-101-NH2表現(xiàn)出八面體形狀，大小約為200 nm.考慮到核酸帶負(fù)電荷性質(zhì)和納米MOF帶正電荷特性，可通過(guò)靜電吸附作用將NA負(fù)載到MIL-101-NH2.DLS分析MIL-101-NH2和MIL-101-NH2-NA，結(jié)果表明：MIL-101-NH2水合直徑約為（274±12）nm，如圖2（b）所示；而修飾NA后的納米粒子水合直徑為（286±10）nm，如圖2（c）所示，說(shuō)明NA吸附后導(dǎo)致納米粒子的水合粒徑稍大，表明NA的成功修飾.為了進(jìn)一步驗(yàn)證MIL-101-NH2-NA的成功制備，對(duì)其進(jìn)行了Zeta電位檢測(cè).如圖2（d）所示，MIL-101-NH2和MIL-101-NH2-NA的Zeta電位分別為+11 mV和-19.7 mV，很好地證明了NA的負(fù)載.為了確定NA的負(fù)載量，通過(guò)質(zhì)量濃度為0.02 g·mL-1的瓊脂糖電泳來(lái)進(jìn)行探究，對(duì)siEGFP，MIL-siEGFP，DNA-Cy3和MIL-DNA-Cy3的條帶進(jìn)行分析，通過(guò)計(jì)算得到siRNA和DNA的負(fù)載量均為7 nmol·mg-1，如圖2（e）和圖2（f）所示.

圖2 MIL-101-NH2-NA的合成及表征.（a）MIL-101-NH2的FESEM圖；（b）MIL-101-NH2的水合粒徑圖；（c）MIL-101-NH2-NA的水合粒徑圖；（d）MIL-101-NH2和MIL-101-NH2-NA的Zeta電位圖；（e）si RNA和MIL-siRNA的2%瓊脂糖電泳圖；（f）DNA和MIL-DNA的2%瓊脂糖電泳圖

2.2 MIL-101-NH2的良好生物相容性

為了考察MIL-101-NH2是否影響Hela細(xì)胞的活力，采用MTT法分別檢測(cè)細(xì)胞在質(zhì)量濃度為20，50和100μg·mL-1MIL-101-NH2中培養(yǎng)24 h的存活情況.結(jié)果顯示：3種不同質(zhì)量濃度的MIL-101-NH2不影響Hela細(xì)胞的細(xì)胞活力，如圖3（a）所示.此外，CLSM的明場(chǎng)成像顯示細(xì)胞形態(tài)完好，如圖3（b）所示，也表明MIL-101-NH2-NA不影響細(xì)胞活力.

圖3 MIL-101-NH2的良好生物相容性.（a）MIL-101-NH2的MTT細(xì)胞活力檢測(cè)；（b）對(duì)照（Control）組（左）與MIL-101-NH2-NA（右）的CLSM明場(chǎng)（bright field）圖像

2.3 MIL-101-NH2-NA的有效細(xì)胞攝取

有效的細(xì)胞攝取是核酸發(fā)揮生物學(xué)功能的首要條件，因此，考察了MIL-101-NH2-NA在Hela細(xì)胞中的攝取效率.將修飾Cy3熒光基團(tuán)的DNA鏈通過(guò)靜電作用吸附到MIL-101-NH2上，與Hela細(xì)胞共同培養(yǎng)24 h.通過(guò)CLSM進(jìn)行細(xì)胞成像，可以看到細(xì)胞中出現(xiàn)紅色熒光，表明MIL-101-NH2-NA通過(guò)內(nèi)吞作用被傳遞到細(xì)胞中，如圖4（a）所示.通過(guò)對(duì)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析和統(tǒng)計(jì)表明：隨著MIL-101-NH2-NA濃度的增加，細(xì)胞攝取也相應(yīng)增加，如圖4（b）所示，這證明MIL-101-NH2-NA可以被細(xì)胞有效攝取.

圖4 MIL-101-NH2-NA的有效細(xì)胞攝取.（a）MIL-101-NH2-NA細(xì)胞攝取CLSM圖（Merge：合并圖）；（b）定量分析不同質(zhì)量濃度下MIL-101-NH2-NA的細(xì)胞攝取差異（n=10）

2.4 MIL-101-NH2載帶核酸能夠?qū)崿F(xiàn)溶酶體逃逸

在成功內(nèi)化進(jìn)細(xì)胞后，有效的溶酶體逃逸是核酸發(fā)揮作用的關(guān)鍵［19-20］.根據(jù)報(bào)道［21］，MIL-101-NH2中存在不飽和Fe（Ⅲ）位點(diǎn)，提供了與富電子官能團(tuán)的內(nèi)在配位性質(zhì).所以，不飽和的Fe（Ⅲ）位點(diǎn)與磷酸鹽離子具有很高的親和力.當(dāng)MIL-101-NH2內(nèi)化并進(jìn)入溶酶體時(shí)，內(nèi)源性高濃度的磷酸鹽離子會(huì)導(dǎo)致MIL-101-NH2的分解.MIL-101-NH2骨架坍塌后，分離的鐵離子與磷酸基團(tuán)的溶酶體膜結(jié)合，破壞溶酶體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而可以促進(jìn)核酸的逃逸和釋放.為了證實(shí)NA的逃逸行為，用CLSM觀察MIL-101-NH2-NA的分布與定位.如圖5（a）所示，當(dāng)MIL-101-NH2-NA與Hela細(xì)胞孵育8 h后，有大量的紅色信號(hào)（DNA-Cy3）與綠色信號(hào)（溶酶體）重疊，表明MIL-101-NH2-NA在Hela細(xì)胞的溶酶體內(nèi)聚集.孵育16 h后，細(xì)胞質(zhì)中大部分綠色信號(hào)（溶酶體）和紅色信號(hào)（DNA-Cy3）分離，提示NA逃離溶酶體的包封，并在細(xì)胞質(zhì)中積累.如圖5（b）和圖5（c）所示，通過(guò)在CLSM圖像上劃線進(jìn)行熒光定量分析，同樣也表明MIL-101-NH2-NA在8 h和溶酶體共定位較多，而到16 h則共定位減少.該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：MIL-101-NH2可以載帶核酸分子進(jìn)入細(xì)胞，且能夠逃脫溶酶體并釋放，為核酸發(fā)揮生物學(xué)功能提供了可能.

圖5 MIL-101-NH2載帶核酸的溶酶體逃逸.（a）MIL-101-NH2-NA（紅色）與lysotracker green（綠色）共定位CLSM圖；（b）定量分析8 h和（c）定量分析16 h時(shí)MIL-101-NH2-NA（紅色）與lysotracker green（黑色）熒光強(qiáng)度圖

2.5 MIL-101-NH2-NA可以發(fā)揮基因沉默效應(yīng)

上述結(jié)果表明，MIL-101-NH2可以有效地負(fù)載核酸分子進(jìn)入細(xì)胞，并且發(fā)生溶酶體逃逸，提示其可能是一種理想的功能核酸的納米載體，所以用MIL-101-NH2負(fù)載EGFP siRNA（MIL-si EGFP）來(lái)探究基因沉默效應(yīng).將MIL-si EGFP與Hela-EGFP細(xì)胞孵育48 h，用熒光顯微鏡觀察EGFP的熒光強(qiáng)度.結(jié)果表明：MIL-siEGFP顯著地降低了EGFP的熒光強(qiáng)度，與lipo 3000轉(zhuǎn)染siEGFP（lipo-si EGFP）效果相似，而游離的si EGFP沒(méi)有這種現(xiàn)象，如圖6（a）所示.為了進(jìn)一步確定基因沉默效率，通過(guò)RT-qPCR定量分析EGFP在mRNA水平的表達(dá).如圖6（b）所示，游離的siEGFP處理的細(xì)胞的EGFP mRNA水平和空白組相比沒(méi)有變化，而lipo-siEGFP處理的細(xì)胞和MIL-siEGFP處理的細(xì)胞的EGFP mRNA水平分別表現(xiàn)出60%和40%的基因沉默效率.這表明：MIL-101-NH2-NA能夠在細(xì)胞內(nèi)有效地發(fā)揮基因沉默效應(yīng).

圖6 MIL-101-NH2-NA的基因沉默效應(yīng).（a）Hela-EGFP細(xì)胞與siEGFP，lipo-siEGFP和MIL-si EGFP孵育48 h的細(xì)胞基因敲除CLSM圖；（b）通過(guò)RT-qPCR定量分析si EGFP，lipo-siEGFP和MIL-siEGFP處理Hela-EGFP細(xì)胞的基因沉默效應(yīng)

3 結(jié)論

綜上所述，本研究制備了納米級(jí)含鐵MOF和MIL-101-NH2，并研究其生物相容性以及其作為核酸載體的特性.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：MIL-101-NH2具有較好的生物相容性，能夠有效地負(fù)載核酸進(jìn)入細(xì)胞，定位在溶酶體里，并發(fā)生溶酶體逃逸.通過(guò)負(fù)載EGFP siRNA證明MIL-101-NH2-NA能夠有效運(yùn)載si RNA進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮基因沉默效應(yīng).本工作可視化地闡明了鐵基納米MIL-101-NH2的細(xì)胞攝取和定位，為其作為納米載體，特別是核酸載體，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了理論指導(dǎo).