銅納米顆粒的仿生合成及其在CT成像中的應(yīng)用

張 欣，褚中運(yùn)，賈能勤

（上海師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，上海200234）

0 引言

銅（Cu）納米材料作為一種重要的金屬材料，具有優(yōu)異的導(dǎo)電導(dǎo)熱性、延展性等性能，并且儲量豐富、價格便宜、環(huán)境友好.因此，在生命科學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)展示了良好的應(yīng)用前景［1-4］.目前，制備Cu納米顆粒的方法有很多［5-6］，主要包含電解法、化學(xué)沉淀法、物理氣相沉積法、水熱法和溶膠-凝膠法等，以上所述的方法各具有不同的特點(diǎn)，但是這些方法不但生產(chǎn)成本高、工藝復(fù)雜，并且容易團(tuán)聚，很難滿足生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用要求［7-8］.基于綠色化學(xué)理念指導(dǎo)的生物仿生合成是納米材料制備的發(fā)展趨勢，其中蛋白類生物大分子已經(jīng)成為金屬納米材料合成中最受歡迎的生物模板之一，具有價格便宜、適宜大規(guī)模生產(chǎn)、較好的穩(wěn)定性和水溶性，以及豐富的表面功能團(tuán)等優(yōu)良性能，以此方法合成的納米顆粒，進(jìn)一步拓展了其在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用范圍［9］.另外，金屬納米粒子對電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）造影劑的豐富和發(fā)展起到了極大的推動作用，金屬原子具有高原子序數(shù)和出色的X射線衰減特性，在相同濃度下，金屬納米粒子提供比碘基造影劑更高的對比度［10-12］.在Cu納米粒子的CT成像應(yīng)用中［13］，一種靶向胃癌的硫化銅（CuS）納米粒子證明了其良好的CT成像效果［14］，通過簡單構(gòu)建聚乙烯吡咯烷酮修飾的硫化銅/鉑納米粒子（Cu2-xS：Pt（0.3）/PVP）納米粒子，可以實(shí)現(xiàn)CT成像介導(dǎo)的化學(xué)光熱協(xié)同治療［15］.本研究中，以蛋清提取物——蛋清白蛋白（CEW）為生物模板，通過條件溫和的一鍋法合成了粒徑均一、水溶液分散性和多溶液體系穩(wěn)定性、生物相容性良好，并具有一定CT增強(qiáng)成像效果的表面包裹蛋清蛋白的納米銅材料（Cu＠CEW）.其合成步驟和應(yīng)用如圖1所示.

圖1 以CEW為模板的Cu＠CEW制備流程及應(yīng)用示意圖

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑及藥品

實(shí)驗(yàn)使用的所有試劑均為分析純等級.氫氧化鈉（NaOH）和五水合硫酸銅（CuSO4·5H2O）等均購自西格瑪；細(xì)胞活力試劑盒（CCK-8）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；所采用的細(xì)胞模型包括人肺癌細(xì)胞A549購自中科院細(xì)胞庫；細(xì)胞培養(yǎng)所使用的試劑RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）等均購自上海秉新生物科技有限公司；實(shí)驗(yàn)過程中的用水均為二次超純水.

1.2 Cu＠CEW納米顆粒的制備

稱取CuSO4·5H2O固體44.7 mg，并在3.581 mL二次水中使其溶解，取其中0.5 mL加入到圓底燒瓶中；稱取提取的CEW 250 mg，并量取9.5 mL二次水配制成CEW溶液，將其加入到圓底燒瓶中.使圓底燒瓶中的溶液體系保持在57℃的恒溫水浴鍋中，持續(xù)磁力攪拌10 min（650 r·min-1）后，迅速加入物質(zhì)的量濃度為1 mol·L-1的NaOH溶液，調(diào)節(jié)溶液pH為10后繼續(xù)攪拌8 h，將過濾所得的產(chǎn)物置于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥.取適量制備得到的Cu＠CEW溶解于PBS中配成溶液，利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜（ICP-OES）精確定量其中Cu的濃度，并保存于4℃冰箱中待用.

1.3 Cu＠CEW納米顆粒的穩(wěn)定性評價

將制備好的Cu＠CEW納米顆粒分散在水、PBS、1640細(xì)胞培養(yǎng)液和血清中，分別靜置12 h和7 d，觀察Cu＠CEW納米顆粒的多溶液體系溶解性和穩(wěn)定性.

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和體外細(xì)胞毒性分析

采用A549細(xì)胞作為細(xì)胞模型研究Cu＠CEW納米顆粒的生物安全性.首先，用完全培養(yǎng)液充分培養(yǎng)A549細(xì)胞（37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2），以每孔8 000個的密度接種到96孔板中.其次，在對數(shù)生長期，移除完培液后，用100μL新鮮的完全培養(yǎng)基（Cu＠CEW納米顆粒的質(zhì)量濃度為0，5，10，15，20，30μg·mL-1）繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h.最后，通過CCK-8測定方法測定A549細(xì)胞的細(xì)胞存活率.

1.5 Cu＠CEW納米顆粒的X射線衰減測試

將不同物質(zhì)的量濃度的Cu＠CEW納米顆粒和碘海醇（Iohexol）轉(zhuǎn)移到EP管中進(jìn)行X射線衰減測試.CT掃描通過Brilliance 64切片系統(tǒng)（Philips Healthcare，Andover，MA），切片厚度為0.625 mm，管電壓為120 kV，視場（FOV）為25.0 cm，管電流為80 mA.CT信號強(qiáng)度通過臨床常用的亨氏單位，數(shù)值反映：亨氏單位數(shù)值越大，CT成像效果越明顯.

2 結(jié)果與討論

2.1 Cu＠CEW納米顆粒的合成與表征

將制備好的納米顆粒均勻分散在水溶液中，借助透射電子顯微鏡（TEM）成像，如圖2（a）所示；隨機(jī)選取200個點(diǎn)，通過分析測得其平均粒徑為4.62 nm，標(biāo)準(zhǔn)差（σ）為0.56 nm，如圖2（b）所示.圖2（a）中納米顆粒呈現(xiàn)出均勻的分散狀態(tài)，表明沒有明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象.在紫外可見吸收光譜中，280 nm左右的吸收峰為CEW的特征吸收，證明了納米顆粒被CEW所包裹，如圖3所示.

圖2 Cu＠CEW的（a）TEM和（b）粒徑分布圖

圖3 Cu＠CEW的紫外可見吸收光譜圖

2.2 Cu＠CEW納米顆粒的穩(wěn)定性

在生物應(yīng)用中，納米顆粒需要具有良好的多溶液分散性和穩(wěn)定性.將Cu＠CEW納米顆粒溶解在水、PBS、1640細(xì)胞培養(yǎng)基和FBS中分別靜置12 h和7 d，如圖4所示，沒有發(fā)現(xiàn)明顯可見的聚集或沉淀.表明Cu＠CEW納米顆粒不僅具有良好的多溶液體系分散性，而且顯示出CEW生物模板制備的納米顆粒的優(yōu)異膠體穩(wěn)定性.

圖4 Cu＠CEW在不同介質(zhì)中（水、PBS、1640細(xì)胞培養(yǎng)基、FBS）的分散性和不同時間（12 h，7 d）穩(wěn)定性比較

2.3 Cu＠CEW納米顆粒的生物相容性

體外細(xì)胞毒性是作為評價納米材料生物相容性的一項(xiàng)重要指標(biāo)，本研究將A549細(xì)胞與Cu＠CEW納米顆粒（0～30μg·mL-1）共孵育24 h和48 h后，通過標(biāo)準(zhǔn)CCK-8分析方法，進(jìn)一步評估了Cu＠CEW納米顆粒的細(xì)胞毒性.如圖5所示，隨著材料濃度的增大和孵育時間的延長，A549細(xì)胞的細(xì)胞存活率仍然保持在80%以上，這表明Cu＠CEW納米顆粒具有比較低的細(xì)胞毒性.

圖5 基于CCK-8分析方法的A549細(xì)胞與Cu＠CEW孵育24 h和48 h后的細(xì)胞存活率

2.4 Cu＠CEW納米顆粒的X射線衰減性質(zhì)

CT成像造影劑必須具有良好的X射線衰減行為.本實(shí)驗(yàn)以現(xiàn)代醫(yī)療常規(guī)使用的造影劑碘海醇作為對照組，測量Cu＠CEW納米顆粒的X射線衰減.如圖6（a）所示，Cu＠CEW納米顆粒的CT成像亮度隨著物質(zhì)的量濃度的增加作有規(guī)律的變化，相較于同濃度下的碘海醇具有更好的成像效果，這進(jìn)一步反映于圖6（b）中的亨氏單位值（HU）變化趨勢上，在相同的濃度條件下，Cu＠CEW納米顆粒具有更高的HU值.因此，Cu＠CEW納米顆粒具有明顯的CT增強(qiáng)效應(yīng).

圖6 Cu＠CEW納米顆粒的X射線衰減性能.（a）0～10 mmol·L-1的Cu＠CEW納米顆粒和碘海醇的CT成像明度圖；（b）0～10 mmol·L-1的Cu＠CEW納米顆粒和碘海醇的HU值直線圖

3 結(jié)論

本研究提出了一種簡單的方法，使用生物模板蛋清提取物CEW，作為穩(wěn)定劑來制備Cu＠CEW納米顆粒，并將其應(yīng)用于CT成像.通過一鍋法合成了均勻分散的Cu＠CEW納米顆粒，平均粒徑為4.62 nm.通過穩(wěn)定性測試，證明其良好的多溶液體系相溶性，而且在較長的時間周期內(nèi)能夠穩(wěn)定存在而不會出現(xiàn)聚沉現(xiàn)象.以A549細(xì)胞為模型，通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明：Cu＠CEW納米顆粒在較高的濃度條件下具有比較低的細(xì)胞毒性.進(jìn)一步與臨床常用的CT造影劑碘海醇相比，該納米粒子具有更好的CT成像效果.