低劑量暴露下呋喃唑酮在大菱鲆體內(nèi)的 遷移規(guī)律及預(yù)測(cè)

邢麗紅，孫偉紅，*，李沂光，彭吉星，李兆新，翟毓秀，*

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237；3.大連工業(yè)大學(xué) 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034）

食品安全問(wèn)題目前已成為人們關(guān)注的一個(gè)重要主題。由于抗生素在畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛使用，相當(dāng)一部分抗生素進(jìn)入環(huán)境中，造成環(huán)境抗生素殘留以及耐藥細(xì)菌的傳播，最終危害人體健康[1-3]。越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始關(guān)注抗生素的環(huán)境污染、環(huán)境生態(tài)毒性及其耐藥性[4-6]， 并建立了一系列用于監(jiān)測(cè)水體[7-9]、飼料[10-17]和沉積物[18-20]等復(fù)雜基質(zhì)中抗生素殘留的高靈敏度檢測(cè)方法。歐盟為收集和快速發(fā)布監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，建立了食品和飼料快速預(yù)警系統(tǒng)以保障消費(fèi)者食用安全[21-22]。

呋喃唑酮是人工合成的具有5-硝基結(jié)構(gòu)的廣譜抗菌藥物，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中曾用來(lái)預(yù)防和治療革蘭氏細(xì)菌引起的腸胃道疾病[23]，是最常見(jiàn)的一種硝基呋喃類(lèi)藥物。該類(lèi)藥物還具有促生長(zhǎng)作用[24]，因此曾作為飼料添加劑在畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛使用[1,8,13,24]。硝基呋喃類(lèi)藥物半衰期很短，在動(dòng)物體內(nèi)代謝迅速，而與蛋白結(jié)合的代謝產(chǎn)物在生物體內(nèi)則能長(zhǎng)期穩(wěn)定殘留[22]，并具有顯著的致畸、致癌和誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生突變的作用[17,23]。 出于安全性考慮，歐盟、美國(guó)和日韓等發(fā)達(dá)國(guó)家先后頒布了禁止使用該類(lèi)獸藥的規(guī)定[1]。我國(guó)于2002年明令禁止在食用動(dòng)物上使用硝基呋喃類(lèi)藥物，并規(guī)定在動(dòng)物源性食品中不得檢出。近年來(lái)我國(guó)加大了食品安全的監(jiān)控和執(zhí)法力度，特別是對(duì)漁用投入品的生產(chǎn)、銷(xiāo)售和使用進(jìn)行了有效監(jiān)督和管理，但仍在少量水產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)了痕量硝基呋喃類(lèi)代謝物殘留。開(kāi)展水產(chǎn)品中痕量藥物殘留的來(lái)源、遷移規(guī)律和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)等方面的研究，可以減少養(yǎng)殖過(guò)程的風(fēng)險(xiǎn)隱患，為保障水產(chǎn)品的食用安全提供參考。

動(dòng)物體內(nèi)殘留的痕量硝基呋喃代謝物，可能源于養(yǎng)殖環(huán)境中被污染的飼料或水體。Mccracken等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在雞飼料中當(dāng)呋喃唑酮以30 μg/kg劑量（0.01%治療劑量）連續(xù)投喂12 d時(shí)，肝臟和肌肉中的呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-噁唑烷基酮（3-amino-2-oxazolidinone，AOZ）殘留量分別為（1.1±0.2）μg/kg和（0.33±0.03）μg/kg，說(shuō)明雞肉中殘留的硝基呋喃類(lèi)代謝物可能來(lái)源于日常飲食或環(huán)境污染。Jakiul等[26]為了確定凍蝦生產(chǎn)過(guò)程中禁用藥物硝基呋喃和氯霉素的來(lái)源途徑，對(duì)投入品包括飼料、飼料添加劑、飼料成分、沉積物和水樣等進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明使用受到抗生素污染的飼料或飼料原料及養(yǎng)殖水體，會(huì)導(dǎo)致抗生素在蝦體內(nèi)殘留。同樣，Conti等[27]也在飼料和食用該飼料的魚(yú)體內(nèi)檢測(cè)到呋喃唑酮和呋喃它酮代謝物殘留。Rizala等[28]開(kāi)展動(dòng)物飼料中硝基呋喃類(lèi)、硝基咪唑類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)3 類(lèi)抗生素殘留評(píng)估，發(fā)現(xiàn)飼料中存在一定程度的抗生素污染。上述研究證明養(yǎng)殖環(huán)境中存在硝基呋喃等抗生素的污染來(lái)源，并導(dǎo)致雞、蝦、魚(yú)等體內(nèi)的藥物殘留，但是還不清楚生物體內(nèi)抗生素殘留量與環(huán)境受污染程度的相關(guān)關(guān)系及可能帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。

大菱鲆（Scophthalmus maximus）是我國(guó)北方重要的海水魚(yú)養(yǎng)殖品種，硝基呋喃藥殘事件曾經(jīng)對(duì)大菱鲆產(chǎn)業(yè)造成毀滅性打擊。本實(shí)驗(yàn)選取大菱鲆作為研究對(duì)象，開(kāi)展飼料中低劑量呋喃唑酮藥物在其體內(nèi)的富集傳遞規(guī)律研究，確定生物富集系數(shù)（bioaccumulation factor，BCF）、預(yù)測(cè)呋喃唑酮污染水平對(duì)大菱鲆體內(nèi)AOZ殘留量的影響，研究結(jié)果將有助于評(píng)價(jià)養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中呋喃唑酮的帶入風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也為大菱鲆的食用安全和合理執(zhí)法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大菱鲆、制作飼料用魚(yú)粉等原料購(gòu)自海陽(yáng)市黃海水產(chǎn)有限公司。

呋喃唑酮（純度＞98%） 上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；AOZ、AOZ-D4標(biāo)準(zhǔn)品 德國(guó)Witega公司； 甲醇、乙酸乙酯、二甲亞砜、乙酸銨、2-硝基苯甲醛（均為色譜純） 德國(guó)Merck公司；鹽酸、磷酸氫二鉀（均為優(yōu)級(jí)純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC20液相色譜儀 日本島津公司；5500液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源） 美國(guó)AB SCIEX 公司；分析天平（感量0.01 g） 德國(guó)賽多利斯集團(tuán)；高速離心機(jī)（6 000 r/min） 美國(guó)Thermo Fisher公司；微量高速離心機(jī)（14 000 r/min） 德國(guó)Sigma公司；渦旋混合器 美國(guó)Talboys公司；Gradient A10 Mill-Q超純水儀 美國(guó)Millipore公司；N-EVAP 112氮?dú)獯蹈蓛x 美國(guó)Organomation公司；IS-RDS3恒溫振蕩器 美國(guó)精騏有限公司。

1.3 方法

1.3.1 呋喃唑酮飼料制作

將飼料按照大菱鲆配料比例充分混合均勻，在飼料中分別以添加量0.5、1.5 mg/kg和5.0 mg/kg添加呋喃唑酮，充分?jǐn)嚢杌旌暇鶆蚝?，用制料機(jī)制成顆粒飼料，－20 ℃冷凍保存。

1.3.2 養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)前隨機(jī)挑選健康、活潑、平均體質(zhì)量為（500±50）g的大菱鲆，在2.5 t圓形養(yǎng)殖缸中暫養(yǎng)2 周后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前檢測(cè)表明，大菱鲆各組織和養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)海水及飼料中均無(wú)呋喃唑酮及其代謝物殘留。馴養(yǎng)期間飼喂不含呋喃唑酮的飼料。海水經(jīng)砂濾，無(wú)污染，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中24 h不間斷充氣，水溫（16±2）℃，pH 8，溶解氧7.5 mg/L，總硬度8 DH。

1.3.2.2 實(shí)驗(yàn)給藥及采樣

實(shí)驗(yàn)前將大菱鲆隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，分別編號(hào)，稱(chēng)量，記錄。對(duì)照組投喂不添加呋喃唑酮的飼料。實(shí)驗(yàn)組設(shè)低、中、高3 個(gè)添加水平，呋喃唑酮添加量分別為0.5、1.5 mg/kg和5.0 mg/kg。實(shí)驗(yàn)組每日投喂含有呋喃唑酮的飼料，日投喂量為體質(zhì)量的1%，每日投喂2 次，上午和下午各一次。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程采用循環(huán)海水養(yǎng)殖。分別于投喂飼料后的0、5、10、15、20、25 d和30 d采集大菱鲆樣品。每次采樣時(shí)，隨機(jī)采集6 尾魚(yú)，用空白海水沖洗干凈體表，分別取肌肉、皮、鰓、肝臟、腎臟、脾臟組織，于－20 ℃冷凍保存。

1.3.3 樣品處理

按照農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告-1-2006進(jìn)行樣品前處理并作適當(dāng)改進(jìn)。

稱(chēng)取2 g樣品于50 mL聚丙烯離心管中，準(zhǔn)確加入50 μL內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混合50 s，再加入5 mL 0.2 mol/L鹽酸溶液和0.15 mL 0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液，渦旋混合50 s后，置于恒溫振蕩器中37 ℃避光振蕩16 h。取出離心管冷卻至室溫，加入1.0 mol/L磷酸氫二鉀溶液，調(diào)節(jié)pH 7.0～7.5，加入乙酸乙酯8 mL，渦旋振蕩1 min，8 000 r/min離心5 min，取上層清液轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，于40 ℃氮?dú)獯蹈?。?zhǔn)確加入5%甲醇溶液1.0 mL，充分渦旋振蕩溶解殘留物，再將溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，10 000 r/min離心10 min，取下層清液過(guò)0.22 μm濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.3.4 樣品測(cè)定

液相色譜條件：色譜柱：Waters XBridge C18柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流速：0.35 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：A為0.002 mol/L乙酸銨溶液，B為甲醇；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase gradient elution procedure

質(zhì)譜條件：離子化模式：電噴霧離子源，正離子模式；噴霧電壓5 500 V；離子源溫度550 ℃；碰撞氣Medium；氣簾氣壓力30 psi；霧化器壓力35 psi；輔助加熱氣壓力35 psi；去簇電壓80 V；射入電壓10 V；碰撞室射出電壓10 V；掃描模式：多反應(yīng)選擇監(jiān)測(cè)，選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)母離子、子離子和碰撞能量見(jiàn)表2。

表2 選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)母離子、子離子和碰撞能量Table 2 Mother ion, daughter ion and collision energy in selective reaction monitoring mode

1.4 數(shù)據(jù)處理

若實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)魚(yú)體中藥物含量變化已基本達(dá)到平衡，此時(shí)魚(yú)體對(duì)藥物的BCF按式（1）計(jì)算：

式中：Cfs為平衡時(shí)魚(yú)體藥物含量/（μg/kg）；Cws為平衡時(shí)飼料中藥物含量/（mg/kg）。

若實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，魚(yú)體中藥物含量未達(dá)到平衡，用BCF30d表示。

采用MetaLab軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合并建模，BCF的計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6 個(gè)平行樣品，以±s表示，相關(guān)系數(shù)R的顯著性差異通過(guò)查閱相關(guān)系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大菱鲆組織中AOZ殘留量與飼料添加量關(guān)系

在低劑量暴露條件下（0.05%～0.5%治療劑量），連續(xù)投喂含呋喃唑酮的飼料30 d，在大菱鲆肌肉、皮、肝臟、腎臟、鰓和脾各組織中均能檢測(cè)到呋喃唑酮代謝物AOZ殘留。以呋喃唑酮添加量為自變量x，以AOZ殘留量為因變量y進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析，結(jié)果表明，大菱鲆各組織中AOZ的殘留量與呋喃唑酮添加量具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。查閱相關(guān)系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表[29]可知，當(dāng)n=6時(shí)，0.811≤R＜0.917表示 0.01＜P≤0.05，顯著相關(guān)，R≥0.917時(shí)表示P≤0.01，極顯著相關(guān)。由表3可知，各組織中線(xiàn)性方程相關(guān)系數(shù)均大于0.917，達(dá)到極顯著水平，即隨著飼料中呋喃唑酮添加量的增大，大菱鲆各組織中AOZ殘留量隨之增大，呈顯著正相關(guān)。線(xiàn)性方程斜率越大，表明相應(yīng)組織中AOZ的殘留量越高。我國(guó)農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告-1-2006規(guī)定了硝基呋喃類(lèi)代謝物檢出限為0.25 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg。當(dāng)呋喃唑酮添加量為0.5 mg/kg時(shí)，連續(xù)暴露5 d，可食組織肌肉中AOZ即可檢出（0.44 μg/kg）， 連續(xù)暴露30 d時(shí)，肌肉組織中AOZ殘留量即達(dá)到 0.68 μg/kg，飼料在受到低劑量呋喃唑酮污染或低劑量違禁添加的情況下，呋喃唑酮代謝物AOZ在大菱鲆體內(nèi)存在蓄積的風(fēng)險(xiǎn)。

表3 大菱鲆各組織中AOZ殘留量與飼料中呋喃唑酮添加量線(xiàn)性方程Table 3 Linear equations between AOZ residue in various tissues of turbot and dose of furazolidone added to feed

Mccracken等[25]為了證明雞肉中殘留的硝基呋喃類(lèi)代謝物可能來(lái)源于日常飲食或環(huán)境污染，按照3 000 μg/kg劑量飼喂雞12 d后，將這些雞轉(zhuǎn)移，在雞舍不做清潔的情況下，重新放入體內(nèi)不含硝基呋喃類(lèi)代謝物的雞，并攝食不含硝基呋喃的飼料和水，24 h后在其肌肉和肝臟中分別檢測(cè)到AOZ殘留，殘留量分別為（0.13±0.04）μg/kg 和（0.01±0.03）μg/kg。Mccracken等[25]此前研究還發(fā)現(xiàn)，將豬置于曾受過(guò)藥物治療但未清潔徹底的豬圈中暴露2 h，可明顯檢測(cè)到AOZ殘留。Jakiul等[26]對(duì)160 份飼料和飼料成分中的硝基呋喃類(lèi)代謝物進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，11 份蝦飼料和10 份魚(yú)飼料中檢出了硝基呋喃類(lèi)代謝物，蝦制品中硝基呋喃類(lèi)抗生素污染來(lái)源于兩方面：1）受污染的飼料和飼料成分；2）在混養(yǎng)過(guò)程中使用禽類(lèi)糞便肥水，而這些禽類(lèi)從開(kāi)始養(yǎng)殖時(shí)便濫用抗生素。Conti等[27]對(duì)同一個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的30 份飼料和食用該飼料的魚(yú)體采用酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定試劑盒對(duì)其抗生素含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果在飼料中檢出包含硝基呋喃類(lèi)代謝物AOZ和AMOZ在內(nèi)的7 類(lèi)抗生素殘留，肌肉中AOZ和AMOZ的平均含量分別為0.09 μg/kg和0.29 μg/kg。在水源和飼料等受低劑量抗生素污染的條件下，硝基呋喃類(lèi)藥物在動(dòng)物體內(nèi)存在蓄積的風(fēng)險(xiǎn)。

2.2 AOZ殘留量-時(shí)間曲線(xiàn)圖（Ci-Ti）

在飼料中分別添加0.5、1.5 mg/kg和5.0 mg/kg呋喃唑酮藥物，其標(biāo)示性代謝物AOZ在大菱鲆肌肉、皮、肝臟、脾、腎臟和鰓中的殘留量隨時(shí)間變化的Ci-Ti見(jiàn)圖1。

圖1 大菱鲆各組織中AOZ殘留量隨時(shí)間變化曲線(xiàn)Fig. 1 Changes in AOZ residue in tissues with feeding time

由圖1可以看出，隨著呋喃唑酮添加量的升高和暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，AOZ在大菱鲆各組織中的殘留量逐漸增加并趨于穩(wěn)定。當(dāng)飼料中呋喃唑酮添加量為0.5 mg/kg時(shí)，AOZ在肌肉、皮和肝臟中達(dá)到穩(wěn)態(tài)富集的時(shí)間均為15 d，在脾中5 d達(dá)到穩(wěn)態(tài)富集，在腎臟和鰓中10 d達(dá)到穩(wěn)態(tài)富集。添加量為1.5 mg/kg時(shí)，AOZ在肌肉、皮、肝臟、脾、腎臟和鰓中均15 d達(dá)到穩(wěn)態(tài)富集，但在脾中出現(xiàn)一定程度波動(dòng)變化。添加量為5.0 mg/kg時(shí)，AOZ在肌肉、皮、肝臟、腎中25 d達(dá)到富集平衡，脾和鰓中15 d達(dá)到富集平衡，并在之后出現(xiàn)一定程度的波動(dòng)上升和下降，30 d時(shí)AOZ殘留量在各組織中略有下降，可能是由于AOZ在體內(nèi)達(dá)到富集平衡后，消除速率大于代謝速率，因而AOZ殘留量出現(xiàn)一定程度下降。

在飼料中添加不同水平的呋喃唑酮藥物，AOZ在大菱鲆不同組織中達(dá)到穩(wěn)態(tài)富集的時(shí)間各不相同，且AOZ在同一組織中的殘留量也有差異。對(duì)于同一組織而言，在飼料中隨著呋喃唑酮添加量的增大，AOZ在各組織中的殘留量相應(yīng)增大，在飼料中達(dá)到穩(wěn)態(tài)富集的時(shí)間也越長(zhǎng)。

2.3 AOZ在大菱鲆各組織中的分布特征

大菱鲆食用含有呋喃唑酮的飼料后，在體內(nèi)快速代謝，在很短時(shí)間內(nèi)即可轉(zhuǎn)化成代謝產(chǎn)物AOZ，并以蛋白結(jié)合態(tài)形式穩(wěn)定存在。AOZ在大菱鲆各組織中的殘留量見(jiàn)圖2。

圖2 不同富集時(shí)間下AOZ在大菱鲆各組織中的分布Fig. 2 Distribution of AOZ in various tissues of turbot at different enrichement times

隨著飼料中呋喃唑酮添加量的增加，其代謝物AOZ在大菱鲆各組織中的殘留量也相應(yīng)增加，其分布呈相似的規(guī)律，AOZ殘留量由大到小依次為肝臟＞腎臟＞脾＞ 鰓＞皮＞肌肉，AOZ在肝臟組織中的殘留量最高，在肌肉中最低。魚(yú)皮中AOZ的殘留量略高于肌肉組織，鰓絲中AOZ殘留量約是肌肉的2～3 倍，而肝臟中AOZ殘留量是肌肉的4～6 倍，腎臟中AOZ殘留量略低于肝臟，脾臟和鰓中AOZ殘留量較為接近。肝臟、脾、腎臟和鰓是參與代謝的重要組織器官，因此也是AOZ殘留量較高的組織。進(jìn)入體內(nèi)的呋喃唑酮藥物在生物體內(nèi)各種酶的作用下，轉(zhuǎn)化為代謝產(chǎn)物，并蓄積在肝臟、腎臟等組織器官中，而后分布到肌肉和皮可食組織中。

2.4 呋喃唑酮在大菱鲆體內(nèi)生物富集能力

生物富集作用是指污染物從環(huán)境中進(jìn)入生物體內(nèi)蓄積，進(jìn)而在食物鏈中傳遞與富集的能力。污染物的生物富集作用越強(qiáng)，對(duì)生物的污染程度與慢性危害作用越大。通常以BCF度量污染物在生物體內(nèi)累積的趨勢(shì)，并作為描述生物對(duì)污染物質(zhì)富集效應(yīng)的指標(biāo)。

同一添加水平下，隨著富集時(shí)間的延長(zhǎng)，AOZ在同一組織中的BCF逐漸升高并趨于穩(wěn)定，藥物進(jìn)入魚(yú)體后，富集過(guò)程與代謝過(guò)程是并存的，初期富集過(guò)程大于代謝過(guò)程，在后期富集和代謝過(guò)程逐漸達(dá)到平衡。但不同組織對(duì)AOZ的生物富集能力不同，AOZ在皮組織中的BCF大于在肌肉組織中的BCF，表明AOZ在魚(yú)皮中更容易蓄積，推測(cè)可能是魚(yú)皮中蛋白含量高于肌肉組織，而AOZ在體內(nèi)主要以蛋白結(jié)合態(tài)形式存在，因而AOZ更容易蓄積在蛋白含量更高的魚(yú)皮組織中。不同添加量下，AOZ在同一組織中的BCF存在差異，大菱鲆體內(nèi)AOZ的蓄積量隨添加量增大而增大，但與飼料中的添加量并不呈等比關(guān)系，在低添加水平條件下呋喃唑酮藥物在大菱鲆體內(nèi)的BCF比高添加水平高。AOZ在肌肉和皮中的BCF見(jiàn)圖3。

圖3 AOZ在大菱鲆肌肉（A）和皮（B）中的BCFFig. 3 Bioconcentration factors of AOZ in the muscle (A) and skin (B) of turbot

李永仁等[30]在研究毛蚶對(duì)石油烴的BCF時(shí)，發(fā)現(xiàn)隨水體石油類(lèi)含量升高，毛蚶對(duì)石油烴的BCF減小，且水體石油類(lèi)含量越高，BCF的減小越緩慢。王曉玲等[31]在研究紫貽貝對(duì)重金屬鎘的生物富集特征時(shí)，同樣也發(fā)現(xiàn)BCF隨暴露劑量增加而逐漸減小，均與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈相似的規(guī)律。隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)和暴露劑量的升高，大菱鲆蓄積能力受到一定影響，其各組織對(duì)呋喃唑酮不能一直維持高蓄積速度，而是具有一定的蓄積平衡點(diǎn)和極限性。BCF隨暴露劑量的升高而下降，這可能與大菱鲆自身的代謝機(jī)能存在一定關(guān)系，即高劑量呋喃唑酮暴露條件下說(shuō)明大菱鲆要把蓄積到體內(nèi)的呋喃唑酮排出體外需要更長(zhǎng)的時(shí)間，而機(jī)體為了避免一定程度的損傷，首先要通過(guò)自身調(diào)控降低體內(nèi)對(duì)呋喃唑酮的蓄積速度。已有研究表明，水生動(dòng)物在一定程度有機(jī)物影響下，可以明顯提高自身抗氧化酶等指標(biāo)的活性降低污染物及其代謝物對(duì)其造成的損傷[32]。

越來(lái)越多的研究表明，畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中使用硝基呋喃類(lèi)藥物等抗生素后，會(huì)進(jìn)入土壤、沉積物、地表水等環(huán)境中，進(jìn)而通過(guò)水源和飼料對(duì)養(yǎng)殖水產(chǎn)品的質(zhì)量安全產(chǎn)生影響，并進(jìn)一步對(duì)人類(lèi)的食用安全和健康造成潛在威脅[3,6,26]。Radovnikovic等[22]對(duì)愛(ài)爾蘭成年人、青少年和兒童3 個(gè)不同組開(kāi)展硝基呋喃類(lèi)代謝物食用安全暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，并在其食用的動(dòng)物源性食品中檢出了硝基呋喃類(lèi)代謝物殘留。因此，開(kāi)展養(yǎng)殖環(huán)境和投入品中抗生素污染的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警，建立評(píng)估模型，用于指導(dǎo)養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐，對(duì)于保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全具有非常重要的意義。

2.5 數(shù)據(jù)模型分析

采用MetLab軟件對(duì)呋喃唑酮藥物不同添加量、不同富集時(shí)間下，AOZ在大菱鲆肌肉組織中的殘留量分別進(jìn)行線(xiàn)性擬合和二次非線(xiàn)性擬合，其中，線(xiàn)性擬合結(jié)果見(jiàn)圖4，表達(dá)式見(jiàn)式（2）：

圖4 肌肉組織線(xiàn)性擬合結(jié)果Fig. 4 Linear fitting result of AOZ residue in muscle

式中：c為肌肉組織中AOZ殘留量/（μg/kg）；x為飼料中藥物添加量/（mg/kg）；y為富集時(shí)間/d。

二次非線(xiàn)性擬合結(jié)果見(jiàn)圖5，表達(dá)式見(jiàn)式（3）：

圖5 肌肉組織二次非線(xiàn)性擬合結(jié)果Fig. 5 Quadratic nonlinear fitting result of AOZ residue in muscle

式中：c為肌肉組織中AOZ殘留量/（μg/kg）；x為飼料中藥物添加量/（mg/kg）；y為富集時(shí)間/d。

和方差（sum of squares due to error，SSE）和確定系數(shù)R2是評(píng)價(jià)模型的兩個(gè)重要指標(biāo)。其中，SSE是指擬合數(shù)據(jù)和原始數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)點(diǎn)誤差的平方和，SSE越接近于0，說(shuō)明模型選擇和擬合越好，數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)越成功。R2是通過(guò)數(shù)據(jù)的變化表征擬合情況，其正常取值范圍為0～1，越接近1，表明這個(gè)模型對(duì)數(shù)據(jù)擬合越好。

通過(guò)比較線(xiàn)性擬合結(jié)果和二次非線(xiàn)性擬合結(jié)果可知，SSE2＜SSE1，因此，采用二次非線(xiàn)性擬合結(jié)果建立模型，對(duì)數(shù)據(jù)的擬合度更好，本實(shí)驗(yàn)選擇二次非線(xiàn)性擬合方式。

歐盟委員會(huì)法規(guī)Council Regulation No. 2377/90將呋喃唑酮列為A類(lèi)禁藥，規(guī)定在食品中不得檢出呋喃唑酮，并規(guī)定了基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室的檢出限不大于1.0 μg/kg。日本2006年實(shí)施的食品中農(nóng)業(yè)化學(xué)品殘留“肯定列表制度”，規(guī)定硝基呋喃類(lèi)代謝物的限量要求為1.0 μg/kg。 我國(guó)水產(chǎn)品質(zhì)量安全例行監(jiān)測(cè)（風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)）（農(nóng)質(zhì)發(fā)[2021]1號(hào)）和產(chǎn)地水產(chǎn)品獸藥殘留監(jiān)控計(jì)劃（農(nóng)漁發(fā)[2021]8號(hào)）中硝基呋喃類(lèi)代謝物的判定限量值為1.0 μg/kg。

當(dāng)AOZ在肌肉組織中的殘留量不小于1.0 μg/kg時(shí)，假設(shè)富集30 d，采用二次非線(xiàn)性擬合模型計(jì)算可知，飼料中的添加量為0.68 mg/kg。即當(dāng)飼料中呋喃唑酮的添加量不小于0.68 mg/kg時(shí)，連續(xù)投喂30 d，大菱鲆肌肉組織中AOZ殘留量不小于1.0 μg/kg。

采用MetLab軟件對(duì)呋喃唑酮藥物不同添加量、不同富集時(shí)間下，AOZ在大菱鲆皮組織中的殘留量進(jìn)行二次非線(xiàn)性擬合（圖6），表達(dá)式見(jiàn)式（4）：

圖6 魚(yú)皮組織二次非線(xiàn)性擬合結(jié)果Fig. 6 Quadratic nonlinear fitting results of AOZ residue in skin

式中：c為魚(yú)皮組織中AOZ殘留量/（μg/kg）；x為飼料中藥物添加量/（μg/kg）；y為富集時(shí)間/d。

當(dāng)AOZ在魚(yú)皮組織中的殘留量不小于1.0 μg/kg時(shí)，假設(shè)富集30 d，采用二次非線(xiàn)性擬合模型計(jì)算可知，飼料中的添加量為0.46 mg/kg。即當(dāng)飼料中呋喃唑酮添加量不小于0.46 mg/kg時(shí)，連續(xù)投喂30 d，在大菱鲆魚(yú)皮組織中AOZ殘留量不小于1.0 μg/kg。

通過(guò)模型預(yù)測(cè)并科學(xué)有效地對(duì)投入品進(jìn)行監(jiān)控，可以減少養(yǎng)殖過(guò)程的帶入風(fēng)險(xiǎn)，有效保障水產(chǎn)品的食用安全。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)選取大菱鲆作為研究對(duì)象，在飼料中以遠(yuǎn)低于治療劑量（1 g/kg）的水平添加呋喃唑酮，測(cè)定大菱鲆體內(nèi)呋喃唑酮代謝物AOZ殘留量，確定飼料添加量與AOZ殘留量關(guān)系、穩(wěn)態(tài)富集時(shí)間、組織分布特征和BCF，并構(gòu)建判別模型預(yù)測(cè)飼料中呋喃唑酮的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中低劑量呋喃唑酮藥物污染，會(huì)導(dǎo)致大菱鲆體內(nèi)AOZ殘留。飼料或飼料原料（如魚(yú)粉）及養(yǎng)殖投入品引入的硝基呋喃類(lèi)藥物污染，可能會(huì)造成魚(yú)體內(nèi)低含量硝基呋喃類(lèi)代謝物殘留。此外，硝基呋喃類(lèi)藥物還具有一定的促生長(zhǎng)作用，具有在飼料中長(zhǎng)期低添加量添加的潛在風(fēng)險(xiǎn)。目前我國(guó)頒布了農(nóng)業(yè)部1486號(hào)公告-8-2010和農(nóng)業(yè)部2349號(hào)公告-6-2015兩項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)用于測(cè)定飼料中硝基呋喃類(lèi)藥物殘留量，其中1486號(hào)公告-8-2010采用高效液相色譜法，其方法檢出限為 0.3 mg/kg，定量限為1.0 mg/kg，對(duì)于飼料中硝基呋喃類(lèi)藥物低于1.0 mg/kg時(shí)，無(wú)法準(zhǔn)確定量。農(nóng)業(yè)部2349號(hào)公告-6-2015采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其檢出限 為0.05 mg/kg，定量限為0.1 mg/kg，相對(duì)于高效液相色譜法，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有更高的靈敏度，可以更準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)飼料污染或是飼料中的非法添加。