高效液相色譜法測(cè)定母乳及牛乳中總核苷酸含量

楊璐桐，于 苗，郭志恒，田 芳，毛穎異，蔡小堃，Philip HASELBERGER，趙艷榮,，謝 林,

（1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，吉林 長春 130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院產(chǎn)科，吉林 長春 130021；3.雅培營養(yǎng)中國研發(fā)中心，上海 200233；4.雅培營養(yǎng)品，美國 俄亥俄 哥倫布 OH43219）

核苷酸是由含氮堿基、五碳糖（核糖或脫氧核糖）和1～3 個(gè)磷酸基團(tuán)組成[1-2]。嘌呤或嘧啶堿基與戊糖分子連接構(gòu)成核苷，核苷酸是核苷的磷酸酯形式，并且可以單磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯形式存在[3]。多個(gè)核苷酸聚合而成核酸，包括DNA和RNA兩大類[4]。母乳中的核苷酸中的氮占非蛋白氮含量的2%～5%[5]，對(duì)嬰幼兒的生長發(fā)育、脂質(zhì)代謝、腸道菌群及腸道發(fā)育、免疫功能等有重要作用[6-10]。核苷酸在母乳和牛乳中的存在形式多種多樣，除游離形式核苷酸外，還富含有核苷聚合物（如RNA）及加合物（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和二磷酸尿苷葡萄糖）等不同核苷形式[11-12]。這些核苷類物質(zhì)可由小腸中的核酸酶及磷酸酶等水解為核苷酸，從而發(fā)揮與核苷酸同等的生理功能[13-15]。母乳中游離核苷酸、游離核苷、核苷聚合物及加合物都可以作為母乳中可利用核苷酸的來源，本研究將不同來源的可利用核苷總量稱為總核苷酸。與大多數(shù)嬰兒配方奶中的牛乳相比，母乳含有更多的核苷酸、核苷等非蛋白氮化合物[16-18]。我國于2005年正式允許核苷酸添加到嬰幼兒配方食品中，允許添加的核苷酸形式為胞嘧啶核苷酸（cytidine monophosphate，CMP）、尿嘧啶核苷酸（uridine monophosphates，UMP）、鳥嘌呤核苷酸（guanosine monophosphates，GMP）、腺嘌呤核苷酸（adenosine monophosphates，AMP）、次黃嘌呤核苷酸（inosine monophosphates，IMP）。

現(xiàn)階段大多數(shù)關(guān)于核苷酸的研究都集中在測(cè)定游離核苷酸上，主要檢測(cè)方法為高效液相色譜法[19-21]，但只檢測(cè)游離核苷酸，未考慮母乳中的核苷加合物和聚合物等物質(zhì)，可能會(huì)低估母乳中可利用的核苷酸總量。所以Leach等[22]用母乳中總潛在可利用核苷的量代表核苷酸總量，建立了一種使用高效液相色譜法檢測(cè)乳汁中總核苷酸的方法。Tressler等[23]參考了Leach等[22]的方法檢測(cè)了亞洲媽媽母乳中的總核苷酸。Liao等[24]建立了中國臺(tái)灣地區(qū)母乳中核苷酸和核苷的檢測(cè)方法。Gill等[25-26]檢測(cè)了牛乳和羊乳中總核苷酸含量。但這些研究關(guān)于母乳中核苷酸的含量和組成的結(jié)果存在較大差異，尤其是在母乳中天然存在的核苷酸類型上。Leach[22]和Tressler[23]等指出，母乳中僅存在CMP、UMP、GMP、AMP四種類型。而Liao等[24]則檢測(cè)出5 種類型，除以上4 種外，還檢測(cè)到IMP。且現(xiàn)有的檢測(cè)母乳中總核苷酸研究中，方法驗(yàn)證數(shù)據(jù)并不全面，僅報(bào)道了加標(biāo)回收率和精密度，線性范圍、檢出限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quantification，LOQ）等鮮見報(bào)道[22-23]。母乳是一種非常復(fù)雜的樣品基質(zhì)，如何消除樣品基質(zhì)的干擾，調(diào)查其天然的核苷酸含量和組成，仍需進(jìn)一步的研究探索。

本研究在Leach等[22]方法的基礎(chǔ)上，對(duì)母乳核苷酸含量和組成的測(cè)定方法進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)，并對(duì)改進(jìn)方法在母乳基質(zhì)中的性能進(jìn)行全面驗(yàn)證。驗(yàn)證參數(shù)包括該方法的分析范圍、線性、LOD、LOQ、準(zhǔn)確性及精密度。進(jìn)一步使用建立的方法檢測(cè)了母乳及市面上常見的5 種牛乳樣品中核苷酸總量和組成，以驗(yàn)證該方法的適用性。

1 材料與方法

1.1 材料

研究使用的母乳樣品為長春地區(qū)成熟乳樣品（n=10，產(chǎn)后40～45 d），收集于吉林省長春市吉林大學(xué)第一醫(yī)院正常產(chǎn)的健康產(chǎn)婦；5 種牛乳樣品購于當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)，分為膜過濾牛乳、巴氏殺菌全脂牛乳、巴氏殺菌脫脂牛乳、超高溫瞬時(shí)滅菌（ultra-high temperature instantaneous sterilization，UHT）全脂牛乳、UHT脫脂牛乳，基本信息見表1。

表1 牛乳樣品營養(yǎng)成分 Table 1 Nutritional information of cow milk samples

1.2 試劑與儀器

磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、六水合氯化鎂、七水合硫酸鋅、乙酸、氫氧化銨（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；己烷磺酸鈉、磷酸、乙腈、異丙醇（均為色譜純） 賽默飛世爾科技公司；胞嘧啶核苷（純度100%）、尿嘧啶核苷（純度100%）、鳥嘌呤核苷（純度99%）、腺嘌呤核苷（純度100%）、次黃嘌呤核苷（純度100%）標(biāo)準(zhǔn)品及5-甲基胞苷（5-methylcytidine，5-MC）（純度≥99%）、1-甲基鳥苷（1-methylguanosine，1-MG）（純度100%）、核酸酶（NP1）、焦磷酸酶、堿性磷酸酶、核糖核酸 美國Sigma-Aldrich公司；硼化聚丙烯酰胺凝膠（Affi-Gel 601） 美國Bio-Rad公司。

1260 Infinity反相高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別準(zhǔn)確稱取5 種核苷標(biāo)準(zhǔn)品（AMP、CMP、GMP、IMP、UMP）30～40 mg（精確至0.000 1 g），用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液定容至100 mL，配制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，－20 ℃保存。用0.25 mol/L磷酸二氫鉀（pH 3.5）溶液將5 種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋50 倍，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度根據(jù) 表2和下式進(jìn)行計(jì)算：

表2 核苷酸的最大紫外吸收波長和換算因子Table 2 Maximum UV absorption wavelengths and calculation factors for nucleotides

分別稱取5-MC 15 mg和1-MG 6 mg，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液定容至25 mL，配制成內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。稀釋10 倍后即成為內(nèi)標(biāo)工作液。

取5 種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1 mL置于同一50 mL容量瓶中，用超純水定容至50 mL。取此混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋成不同質(zhì)量濃度，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（表3）。將混合標(biāo)準(zhǔn)工作液依次進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄各組分色譜圖上的峰面積。以混合標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度的比值（X）為橫坐標(biāo)，以各組分的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 1.3.2 樣品前處理

表3 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制Table 3 Preparation of mixed standard working solutions

準(zhǔn)確吸取0.5 mL母乳樣品或牛乳樣品于玻璃瓶中，加入250 μL內(nèi)標(biāo)工作液和2.5 mL水，110 ℃加熱15 min，取出冷卻至室溫。再依次加入1 mL醋酸鈉溶液（0.1 mol/L，pH 5.1）、25 μL硫酸鋅溶液（0.01 mol/L） 和50 μL NP1（～2.5 個(gè)單位），37 ℃酶解16～18 h。酶解結(jié)束后，再加入0.5 mL醋酸銨溶液（0.5 mol/L，pH 8.75）、25 μL氯化鎂溶液（1 mol/L）、25 μL氫氧化銨、25 μL焦磷酸酶（～12 個(gè)單位）和25 μL堿性磷酸酶（～7 個(gè)單位），37 ℃酶解3 h，酶解后的樣品用磷酸二氫鉀溶液（0.5 mol/L，pH 10.5）定容至12 mL。

1.3.3 固相萃取

將硼化聚丙烯酰胺凝膠與磷酸二氫鉀溶液（0.1 mol/L， pH 6.5）按1∶100的比例充分混合后，取0.5 mL分裝于1.5 mL離心管中。將離心管中的水合沉淀凝膠用磷酸溶液（0.25 mol/L）渦旋洗滌1 次，再用磷酸二氫鉀溶液（0.25 mol/L，pH 10.5）渦旋洗滌1 次，3 000 r/min離心2 min并除去上清液。取1 mL處理好的樣品加入洗滌后的凝膠中并渦旋，靜置15 min，使核苷吸附于凝膠上。再次用磷酸二氫鉀緩沖液（0.25 mol/L，pH 10.5）進(jìn)行2 次洗滌，3 000 r/min離心2 min并除去上清液。母乳中含有多種營養(yǎng)素，除核苷酸能吸附在凝膠上，其他物質(zhì)也可能吸附在凝膠上，用磷酸二氫鉀洗滌2 次則是為了除去這些吸附在凝膠上的可能影響結(jié)果的物質(zhì)，但不會(huì)影響吸附在凝膠上的核苷。向離心管中加入1 mL磷酸溶液（0.25 mol/L）并充分渦旋，此時(shí)核苷從凝膠中洗脫出來，然后將離心管中的液體通過0.2 μm尼龍濾膜直接進(jìn)入進(jìn)樣小瓶進(jìn)行高效液相色譜分析。

1.3.4 色譜條件

色譜柱為Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），進(jìn)樣量100 μL，進(jìn)樣盤溫度16 ℃，柱溫22 ℃，檢測(cè)波長260 nm。流動(dòng)相A為21.75 mmol/L醋酸銨溶液（pH 4.27）-2 mmol/L己烷磺酸鈉；流動(dòng)相B為流動(dòng)相A-乙腈（100∶6，V/V）。梯度洗脫程序見表4。

表4 高效液相色譜檢測(cè)總核苷酸梯度洗脫程序Table 4 Gradient elution program for HPLC analysis of total nucleotides

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 24.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。采用單因素方差分析ANOVA評(píng)估多個(gè)樣本間數(shù)據(jù)差異的顯著性。若結(jié)果有顯著性差異，用最小顯著性差異法進(jìn)行樣品間的兩兩比較。P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的優(yōu)化

考慮到母乳樣品量的有限性，在樣品前處理時(shí)將樣品使用量減至0.5 mL，并驗(yàn)證方法的靈敏度。使用5-MC作為AMP、UMP、CMP及IMP的內(nèi)標(biāo)，同時(shí)使用1-MG作為GMP的內(nèi)標(biāo)。因GMP在硼化聚丙烯酰胺凝膠上的保留時(shí)間較其他4 種核苷酸長，1-MG與其性質(zhì)更接近，可以更加精確地對(duì)其進(jìn)行定量。

關(guān)于核苷酸在母乳中的天然存在類型，本研究也進(jìn)行了探討。有研究報(bào)道母乳中存在腺苷脫氨酶、酸性磷酸酶等活性酶[27]，這些酶的存在可能會(huì)改變母乳中核苷酸的天然組成，造成前言中所述不同研究間結(jié)果的差異較大。研究顯示，高溫加熱一定的時(shí)間（110 ℃加熱15 min）可以使乳汁中存在的活性酶充分滅活[23]。所以本研究在進(jìn)行樣品前處理時(shí)，增加高溫滅活步驟，并通過加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證有無此步驟對(duì)核苷酸檢測(cè)結(jié)果的影響。選擇一個(gè)母乳樣品為基質(zhì)，3 d 6 次測(cè)定結(jié)果的平均值確定該基質(zhì)中各核苷酸及核苷酸總量的本底值（為得到穩(wěn)定的本底值，在處理樣品過程中增加了高溫滅活步驟，因此樣品中未檢出IMP），其加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。未增加高溫滅活步驟時(shí)，CMP、UMP及GMP的回收率分別為98%、122%及85%，基本符合檢測(cè)方法性能指標(biāo)的要求；但AMP和IMP的加標(biāo)回收率分別為15%及180%，提示兩種核苷酸在前處理過程中可能發(fā)生了相互轉(zhuǎn)化。增加高溫滅活步驟后，AMP和IMP的加標(biāo)回收率回歸至可接受范圍（分別為93%及80%），結(jié)果同時(shí)顯示有無高溫滅活步驟對(duì)總核苷酸含量的檢測(cè)無顯著影響。母乳中的腺苷脫氨酶可以將AMP轉(zhuǎn)化為IMP[28]，而增加高溫加熱步驟可以使腺苷脫氨酶失去活性，從而可以檢測(cè)到母乳中核苷酸的真實(shí)含量和組成，而且大部分研究均未報(bào)道IMP含量[22,29-30]，僅有少部分研究報(bào)道了IMP含量[24]。本研究進(jìn)一步證實(shí)了Leach[22]及Tressler[23]等的研究結(jié)果，母乳中主要含有CMP、UMP、AMP及GMP四種核苷酸，IMP為樣品前處理不當(dāng)致使AMP轉(zhuǎn)化的結(jié)果。

表5 有無高溫滅活步驟時(shí)加標(biāo)回收率結(jié)果對(duì)比Table 5 Comparison of recoveries of spiked samples with and without high-temperature inactivation step

2.2 線性、LOD及LOQ測(cè)定結(jié)果

取配制的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液對(duì)該方法的分析范圍及線性關(guān)系進(jìn)行考察，結(jié)果見表6。5 種核苷酸在各自的分析范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均在0.999以上。計(jì)算10 個(gè)母乳樣品中待分析物色譜峰的平均信噪比（RSN），并將RSN為3對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度作為本方法各核苷酸的LOD，RSN為10對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度作為本方法各核苷酸的LOQ，經(jīng)檢驗(yàn)LOD為0.18～0.45 mg/L，LOQ為0.60～1.51 mg/L。圖1為母乳樣品的典型色譜圖，本方法使用硼化聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行樣品凈化，各種類型的核苷酸分離度較好，且雜峰少，本方法具有非常好的靈敏度。

表6 線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)r2、LOD和LOQTable 6 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r2), LODs and LOQs

圖1 母乳樣品中核苷酸譜圖Fig. 1 Chromatogram of nucleotides in human milk

2.3 精密度及回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選擇一個(gè)母乳樣品為基質(zhì)，3 d 6 次測(cè)定結(jié)果的平均值確定該基質(zhì)中各核苷酸及核苷酸總量的本底值。加入不同體積的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，使用建立的方法測(cè)定總核苷酸，驗(yàn)證結(jié)果見表7。本研究選擇3 個(gè)不同的加標(biāo)質(zhì)量濃度，分別約為基底質(zhì)量濃度的30%、50%和120%。在50%及120%質(zhì)量濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收以驗(yàn)證含量測(cè)定的準(zhǔn)確性；30%質(zhì)量濃度水平貼近并稍高于計(jì)算所得的LOQ，可以驗(yàn)證其作為母乳樣品檢測(cè)實(shí)際LOQ的適用性。結(jié)果表明，各核苷酸的加標(biāo)回收率均在82%～120%之間，總核苷酸的加標(biāo)回收率均在99%～108%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在0.8%～7.8%之間，表明此方法具有良好的準(zhǔn)確性及精密度。CMP、UMP、GMP、AMP及IMP在母乳中的實(shí)際檢測(cè)LOQ分別為2.60、2.00、1.98、2.31、1.97 mg/L。

表7 母乳樣品中總核苷酸的加標(biāo)回收率及精密度（n =6）Table 7 Recoveries and precision of total nucleotides in spiked human milk samples (n = 6)

2.4 母乳及牛乳樣品的測(cè)定與分析

采用上述方法檢測(cè)長春地區(qū)收集的10 個(gè)成熟乳樣品（40～45 d）及5 種不同加工工藝生產(chǎn)的牛乳樣品（膜過濾牛乳、巴氏殺菌全脂牛乳、巴氏殺菌脫脂牛乳、UHT全脂牛乳和UHT脫脂牛乳）中總核苷酸的含量及組成，檢測(cè)結(jié)果見表8。所檢測(cè)的母乳和牛乳樣品中不同種類核苷酸及總核苷酸含量均在本方法線性范圍內(nèi)，且檢測(cè)值均高于LOQ（0.60～1.51 mg/L）。每個(gè)樣品在檢測(cè)時(shí)均設(shè)置平行樣，結(jié)果平行性好。該方法的靈敏度及精密度均可滿足對(duì)母乳和牛乳樣品中天然的核苷酸含量及組成的測(cè)定要求。

表8 牛乳及母乳樣品中總核苷酸含量 Table 8 Contents of total nucleotides in cow milk and breast milk samples

在檢測(cè)過程中發(fā)現(xiàn)母乳中總核苷酸含量具有較大的個(gè)體差異性，不同母乳樣品含量相差近10 倍（10.85～101.57 mg/L），Leach等[22]研究結(jié)果也表明母乳中核苷酸含量具有較大的個(gè)體差異 （82～402 μmol/L）。有報(bào)道指出母乳中RNA質(zhì)量濃度范圍為100～5 600 mg/L[31]，而RNA在乳汁中所占比例約為40%～56%，所以母乳中核苷酸的個(gè)體差異可能主要受RNA含量的影響。為進(jìn)一步驗(yàn)證此假設(shè)，本研究使用低核苷酸含量的母乳樣品作為基質(zhì)進(jìn)行RNA加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性，結(jié)果見表9。重復(fù)檢測(cè)3 次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明RNA的加標(biāo)回收率為98%，表明乳汁中的RNA可以被完全水解，低核苷酸含量的母乳中并無影響方法性能的干擾因素。RNA加標(biāo)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了本方法對(duì)母乳基質(zhì)普遍適用，所測(cè)結(jié)果可以反映乳汁中真實(shí)的核苷酸水平。

經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，母乳中總核苷酸含量顯著高于5 種不同牛乳（P＜0.05），牛乳中總核苷酸的含量約為母乳中含量的一半或更低。本研究中膜過濾牛乳、巴氏殺菌全脂牛乳和巴氏殺菌脫脂牛乳中總核苷酸含量均高于UHT全脂牛乳和UHT脫脂牛乳（P＜0.05）。膜過濾牛乳、巴氏殺菌全脂及脫脂牛乳均產(chǎn)自中國，UHT全脂及脫脂牛乳產(chǎn)自新西蘭，這兩類牛乳之間的差異可能源自產(chǎn)地，也可能源自加工方式。有研究報(bào)道季節(jié)因素會(huì)影響牛乳中總核苷酸含量，氣候條件、母牛的飼養(yǎng)和喂養(yǎng)條件，日光照射和其他環(huán)境因素都可能影響牛乳中總核苷酸含量[26]。所以不同牛乳間含量差異的原因仍需進(jìn)一步探究。

本研究還對(duì)乳汁中各種核苷酸所占比例進(jìn)行比較，各種核苷酸在牛乳和母乳中所占的比例如圖2所示。母乳和牛乳中均以嘧啶類核苷酸為主（78%～93%），嘌呤類核苷酸為輔（7%～22%）。但母乳中CMP占據(jù)主導(dǎo)地位，牛乳中則以UMP為主，且母乳中的嘌呤類核苷酸高于牛乳。母乳和牛乳之間的差異不僅體現(xiàn)在含量上，在核苷酸組成方面也存在差異。

3 結(jié) 論

本研究建立了一種高效、準(zhǔn)確測(cè)定母乳和牛乳中總核苷酸含量和組成的方法。該方法具有較好的靈敏度、準(zhǔn)確性和精密度，能滿足日常對(duì)母乳或牛乳樣品中總核苷酸的定性和定量測(cè)定要求。本研究根據(jù)母乳樣品的特性，樣品前處理中增加了高溫滅活步驟，消除了母乳中活性酶對(duì)核苷酸組成的影響，對(duì)研究母乳中核苷酸的組成有重要意義。應(yīng)用研究結(jié)果顯示，母乳中的總核苷酸含量明顯高于牛乳，牛乳中的含量約為母乳的一半。嘧啶核苷酸（CMP、UMP）是母乳和牛乳中主要的核苷酸形式，嘌呤類核苷酸（AMP、GMP）所占比例較小，且未檢測(cè)到IMP。本研究為今后母乳和牛乳的核苷酸總量及組成研究提供了一種更加科學(xué)準(zhǔn)確的方法。