歐李果膠理化特性及乳化性質

張士凱，何子楊，秦偉帥，程 月，許方舟，李來成，吳 澎,

（1.山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東省高校食品加工技術與質量控制重點實驗室，山東 泰安 271018；2.泰山學院生物與釀酒工程學院，山東 泰安 271000）

果膠是一種復雜的多糖，主要由同型半乳糖醛酸聚糖（homogalacturonans，HG）、鼠李糖半乳糖醛酸I （rhamnogalacturonans I，RGI）、鼠李糖半乳糖醛酸II （rhamnogalacturonans II，RGII）的結構域組成[1]。果膠可以從多種植物中提取，包括蘋果、梨、向日葵和柑橘類水果（果膠含量相對較高）[2]，以及柔軟的水果如葡萄和櫻桃（果膠含量相對較少）[3]。根據(jù)酯化性質的不同，果膠通常分為高甲氧基果膠（酯化度（degree of esterification，DE）＞50%）和低甲氧基果膠 （DE＜50%），具有乳化、膠凝、抗氧化和增稠等多種功能特性[4]。近年，從各種水果或蔬菜的加工衍生材料中制備果膠已經(jīng)成為熱點。

歐李為薔薇科櫻屬植物，因其含鈣量高，又被稱為“鈣果”。由于其誘人的顏色、獨特的風味及豐富的營養(yǎng)物質，已經(jīng)被廣泛加工為果酒、果醋、飲料等產(chǎn)品[5]。但是歐李的貯藏期較短，在生長-成熟-采收階段，會出現(xiàn)不可避免的落果現(xiàn)象，造成經(jīng)濟損失；在處理加工過程中，也會產(chǎn)生大量的廢棄物，主要包括果皮、果核和不完整果肉。因此，研究這些落果和廢棄物具有較大的經(jīng)濟效益。目前關于歐李中果膠的開發(fā)、結構及乳化性質的報道較少，本實驗旨在尋找一種果膠的新來源，為擴大歐李的利用提供理論基礎。

本實驗采用常規(guī)熱酸法從歐李落果及加工廢棄物中提取果膠，測試果膠的理化特性、表觀結構、傅里葉變換紅外光譜、Zeta電位、單糖組成、結晶性質。并以市售蘋果果膠作為對比，比較2 種果膠的乳化指數(shù)、乳化能力和乳化穩(wěn)定性，并測試2 種果膠乳液貯存期間的液滴粒徑和顯微結構。以期為歐李果膠（Cerasus humilis fruit pectin，CSP）作為乳化劑提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

商品蘋果果膠（commercial apple pectin，CAP） 山東齊魯生物科技公司；歐李落果及加工廢棄物 山東云農(nóng)集團；鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸及膽固醇 標準品 上海葉源生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

GCMS-QP 2010氣相色譜-質譜聯(lián)用儀 日本島津公司； VERTEX 70傅里變換葉紅外光譜儀、D8 ADVANCEX射線衍射儀 德國Bruker公司；SpectraMax M5多功能酶標儀 丹麥BioPorto公司；IX73熒光倒置顯微鏡 日本 奧林巴斯公司；Nano S90激光粒度分析儀 美國Beckman Coulter公司；AR2000ex流變儀 美國賽默飛公司；Supra 55掃描電子顯微鏡 德國Zeiss公司；IKA T18高速均質機 德國IKA公司；SCIENTA-10N冷凍凍干機 寧波新芝生物科技；ICPMS7800電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀 美國安捷倫公司；TGL-20b R高速臺式冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 果膠提取

歐李落果及加工廢棄物，除去落果及廢棄物中的果核，冷凍干燥機內(nèi)干燥48 h，粉碎，過60 目，貯存于干燥器。參考Jiang Yang等[6]方法，并略作修改。以料液比1∶10（g/mL）加入95%乙醇溶液，加熱至沸騰15 min。待其自然冷卻，適量無水乙醇洗滌3 次，最后用丙酮洗滌1 次得醇不溶性固體（alcohol insoluble solids，AIS）。

以料液比1∶20（g/mL）將AIS與蒸餾水混合，用2 mol/L檸檬酸溶液將混合液pH值調(diào)節(jié)至2，置于90 ℃水浴120 min，恒定攪拌500 r/min。所得上清液4 ℃醇沉過夜，得粗果膠。粗果膠用無水乙醇洗滌2 次，用3.5 kDa透析袋處理48 h以去除雜質，最后通過冷凍干燥得純化果膠。

1.3.2 理化性質測定

蛋白質含量測定采用Bradford[7]的方法；灰分和水分含量采用Zouambia等[8]的方法。干燥減量采用直接干燥法[9]。

將適量的果膠與2.0 mL四氫呋喃充分混合，超聲浴中處理1 h，用0.45 μm微孔膜過濾，采用福林-酚比色法測定其總多酚含量[10]。均一式3 份，重復3 次進行測試。

1.3.3 金屬元素檢測

利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀檢測CAP和CSP中金屬元素組成，采用外校準法和內(nèi)標法校正儀器，對Ca、Zn、Mg和Pb等元素進行定量分析。

1.3.4 半乳糖醛酸含量測定

采用Lin Zhuangsheng等[11]的方法并作適當修改。用酶標儀在波長525 nm處測定吸光度，以D-半乳糖醛酸為標準品作標準曲線用以測定半乳糖醛酸含量。一式3 份，重復3 次進行測試。

1.3.5 掃描電鏡分析

充分水合的CSP和CAP溶液（20 g/L）冷凍干燥以獲得果膠，將果膠置于雙面膠帶上并涂薄金層，用3.00 kV的加速電壓于掃描電子顯微鏡拍攝樣品的形貌特征，放大倍數(shù)為1 000。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜與DE分析

1 mg果膠與100 mg KBr混合并充分研磨壓制為薄片，于4 000～400 cm－1進行64 次掃描，分辨率為4 cm－1， 經(jīng)去噪和基線校正后得到吸收光譜。并利用傅里葉變換紅外光譜計算果膠酯化度[11]，即根據(jù)1 740 cm－1處峰面積與1 740、1 630 cm－1處峰面積之和的比進行計算[12]。

1.3.7 X射線衍射分析

果膠樣品在10°～60°衍射角（2θ）范圍內(nèi)掃描，Cu-K-α輻射電壓為40 kV，電流為40 mA。

1.3.8 流變學性質

配制20 g/L的CSP和CAP溶液，充分均勻后過夜使其完全水合。剪切速率為0.01～100 s－1，使用流變儀測定CSP和CAP的表觀黏度。

1.3.9 單糖組成分析

取2 mg果膠樣品至安培瓶，加入1 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液，封管，120 ℃酸解90 min，揮干三氟乙酸。殘基加入2 mL雙蒸水、100 mg硼氫化鈉還原，加入冰醋酸中和，濃縮，烘干，加入1 mL乙酸酐乙酰化，100 ℃反應1 h，冷卻。加入3 mL甲苯，減壓濃縮蒸干，重復4～5 次，以除去多余的醋酐。將乙?；a(chǎn)物溶解于3 mL氯仿轉移至分液漏斗，加少量蒸餾水，充分振蕩以去除上層水溶液，重復5 次。氯仿層以適量的無水硫酸鈉干燥，定容至10 mL，分析采用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀測定乙酰化產(chǎn)物樣品。

氣相色譜-質譜條件：RXI-5 SIL MS色譜柱（30 m×0.25 m，0.25 mm）；升溫程序：起始溫度120 ℃，以3 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min；進樣口溫度250 ℃，檢測器溫度250 ℃，載氣為氦氣，流速 1 mL/min。標準品順序為鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖。

1.3.10 乳液制備

按照Schmidt等[13]的方法制備乳液。將完全水合的果膠溶液（10 mL，0.5%、1.0%、1.5%、2.0%）與等量的玉米胚芽油混合，使用高速均質機14 000 r/min勻漿2 min以獲得乳狀液。

1.3.11 乳化性質及穩(wěn)定性

乳化指數(shù)按照Ahsan等[14]的方法進行測定，記錄30 d內(nèi)乳狀液高度變化。乳化能力及乳化穩(wěn)定性按照 Bayar等[15]的方法進行測定，將乳狀液4 500 r/min離心5 min，測量乳液體積，之后80 ℃恒溫水浴30 min，4 500 r/min離心5 min，測量剩余乳液體積。分別按下式計算：

式中：Hs為貯存1～30 d后測得上清液層高度/mL；He為整個乳液系統(tǒng)高度/mL；Vm為乳液的初始體積/mL；Ve為第1次離心后的乳液體積/mL；Vi為80 ℃貯存30 min后剩余的乳化層體積/mL。

1.3.12 流變學分析

為比較CAP和CSP的乳化能力，使用流變儀測試乳狀液流變學性質，在25 ℃進行穩(wěn)定剪切，剪切速率在0.01～100 s－1之間。

1.3.13 液滴粒徑和顯微鏡結構分析

采用激光粒度分析儀測量乳狀液的液滴粒徑分布，水和乳液的折射率設定為1.470和1.330。采用熒光倒置顯微鏡觀察乳狀液微觀結構。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結果與分析

2.1 理化性質

本實驗采用1.3.1節(jié)方法提取CSP，并與CAP進行對比。如表1所示，CSP和CAP的半乳糖醛酸質量分數(shù)、灰分質量分數(shù)和干燥減量分別為70.42%/75.92%、1.25%/5.03%和3.43%/10.09%，均未檢出Pb元素，符合GB 25533—2010《果膠》的標準。CSP的蛋白質和總多酚含量明顯高于CAP（P＜0.05），而灰分低于CAP （P＜0.05）；CSP中Ca、Zn和Mg元素含量均高于CAP，這或許能為CSP提供更多良好的性質（凝膠性和乳化性）[16]； 通過傅里葉變換紅外光譜分析得CSP和CAP的DE，分別為52.04%（＞50%）和40.72%（＜50%），分別屬于高甲氧基果膠和低甲氧基果膠，這與果膠的來源及提取方式有關[17]。果膠結構主要為D-半乳糖醛酸單元組成的線性鏈，并具有D-半乳糖和L-阿拉伯糖側鏈。CSP和CAP中性單糖含量順序為阿拉伯糖＞半乳糖＞鼠李糖＞ 葡萄糖/木糖（CAP）＞木糖/葡萄糖（CAP），其中阿拉伯糖和半乳糖是CSP和CAP中主要中性單糖，少量的葡萄糖可能來自提取過程中殘留的可溶性糖或非果膠多糖中的葡萄糖聚合物[18]。綜合分析，CSP的組成與 Hosseini等[19]提取的櫻桃果膠相似，且含有較少的其他多糖，如纖維素。

表1 CAP和CSP的理化指標Table 1 Physiochemical indexes of CSP and CAP

2.2 掃描電鏡結果

如圖1所示，CAP呈現(xiàn)為柔軟且粗糙的絮凝團結構，而CSP呈光滑、連續(xù)和卷曲的片狀或絲狀結構，這些片狀結構含有少量的分散小顆粒。這與火龍果[17]、馬鈴薯[18]和柚子皮[20]中所提果膠微觀結構相似。相比CAP，CSP有更多的線性結構和分支，已有研究證明，果膠的線性結構和分支與其發(fā)揮乳化性能有著密切關聯(lián)[21]。

圖1 CSP（A）和CAP（B）的掃描電鏡Fig. 1 SEM images of CSP (A) and CAP (B)

2.3 傅里葉變換紅外光譜結果

如圖2所示，3 420 cm－1附近的強峰是分子間和分子內(nèi)氫鍵引起的O—H伸縮振動，2 935 cm－1附近的吸收峰是由果膠中C—H伸縮引起的，包括CH、CH2和CH3的彎曲振動，是多糖化合物的典型結構[22]。 1 740 cm－1和1 629 cm－1處的峰分別代表酯化羧基 （—COOR）和游離羧基（—COO－），可以計算出CAP和CSP的DE，分別為40.72%和52.04%。1 500 cm－1以下的中等吸收強度的峰通常被認為果膠的“指紋”域，1 105 cm－1和1 015 cm－1處的吸收峰代表C—C、C—O、C—CH和OCH的振動[23]，反映了果膠中HG含量，根據(jù)峰面積可以看出，CSP中HG含量大于CAP，證明CSP有更長的骨干結構[24]。

圖2 果膠樣品傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 2 FTIR spectra of CSP and CAP

2.4 X射線衍分析

果膠的結晶度通?？梢杂蒟射線衍射譜圖中尖銳和寬泛的衍射峰進行確定，這些峰代表果膠中大量羧基的系統(tǒng)性多半乳糖醛酸結構[25]。如圖3所示，結果證實了CAP和CSP的無定形性質。這與櫻桃[19]、茄子[26]和開心果[27]中提取的果膠性質相似。果膠結晶性質的差異與其性質、來源及提取方法有較大關系。

圖3 果膠的X射線衍射譜圖Fig. 3 XRD spectra of CSP and CAP

2.5 Zeta電位

果膠是一種富含半乳糖醛酸的酸性多糖，較高的pH值會引起羧基的解離，導致負Zeta電位降低。如圖4所示，在pH 3～5時，果膠的負Zeta電位均隨著pH值升高而降低，在pH 5～7范圍內(nèi)則保持相對穩(wěn)定。在所有pH值條件下，CSP的負Zeta電位均大于CAP，測試過程中CAP可能發(fā)生了質子化反應，導致部分帶負電羧基的缺少，從而表現(xiàn)出較高的負電位值[28]。已有研究證明，果膠中負電荷數(shù)量越多，其分散性和穩(wěn)定性質越好[29]，這與果膠發(fā)揮較好的乳化性能有著密切關聯(lián)。

圖4 果膠的Zeta電位趨勢圖Fig. 4 Zeta potential profiles of CSP and CAP

2.6 果膠黏度

如圖5所示，2 種果膠表現(xiàn)出剪切變稀的性質，為假塑性非牛頓流體。與CAP對比，CSP有著更高的黏度和更強的抗剪切能力。黏度較高的CSP能夠降低乳狀液的流動性，并阻礙了液滴的移動或聚集，從而提高了乳液貯存穩(wěn)定性[30]。

圖5 果膠的流變特性Fig. 5 Rheological properties of CSP and CAP

2.7 乳液性質

2.7.1 外觀、顯微結構觀察和粒徑分析

分別制備不同質量分數(shù)（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%）CAP和CSP乳液，在4 ℃環(huán)境中貯存30 d，并用數(shù)碼相機記錄配制1 h和30 d后的乳液外觀形態(tài)，用以觀察乳液物理穩(wěn)定性（圖6）。可以看出，放置1 h后，不同質量分數(shù)的CAP乳液均立即發(fā)生相分離，30 d后乳相高度變化不大，下層清澈，分離明顯，發(fā)現(xiàn)破乳，且 CAP-1.0%、CAP-1.5%和CAP-2.0%乳相高度相似，說明當CAP質量分數(shù)大于1.0%時，增加CAP質量分數(shù)不能有效改善乳液的穩(wěn)定性。CSP乳液在1 h后無明顯相分離，30 d后，CSP-0.5%分層明顯，CSP-1.0%有少量的相沉淀，分層不明顯，CSP-1.5%和CSP-2.0%幾乎未觀察到相的分離，在整個實驗過程中保持了較好的均勻性和穩(wěn)定性。這些現(xiàn)象直觀的表明了CSP的乳化性質和穩(wěn)定性明顯好于CAP。

圖6 不同質量分數(shù)CSP、CAP乳液外觀形態(tài)Fig. 6 Appearance of emulsions stabilized by CSP or CAP at different concentrations

如圖7所示，在果膠質量分數(shù)0.5%～2.0%范圍內(nèi)，乳液穩(wěn)定性與果膠濃度呈正相關。相比于CSP，所有CAP乳液均發(fā)生了不同程度的絮凝和破乳，導致乳液液滴粒徑增加，加大了體系不穩(wěn)定性風險，說明市售蘋果果膠乳化性能較差。在較低質量分數(shù)條件下，CAP體系中能夠覆蓋油滴表面的可用顆粒較少，不足以完全穩(wěn)定油滴，從而形成較大的液滴，并發(fā)生破乳、絮凝等現(xiàn)象。CSP體系較為穩(wěn)定，可能是CSP賦予了液滴間更大的靜電斥力，從而使界面上的吸附更有效，這與本實驗Zeta電位數(shù)據(jù)一致（圖4）。貯存30 d后的乳液液滴粒徑分布如圖8所示，液滴粒徑分布趨勢與相應乳液穩(wěn)定性和顯微鏡觀察一致，隨著果膠含量增加，液滴粒徑減小，CSP乳液平均粒徑大于相同質量分數(shù)的CAP。一般認為，減小液滴粒徑可以增加連續(xù)相黏度，從而獲得較高的乳液穩(wěn)定性[31-32]。

圖7 不同質量分數(shù)CSP、CAP放置30 d后乳液的顯微結構Fig. 7 Microstructures of emulsions stabilized by CSP or CAP at different concentrations after 30 days of storage

圖8 CSP和CAP的液滴粒徑分布Fig. 8 Droplet size distribution of emulsions stabilized by CSP or CAP at different concentrations

2.7.2 乳液乳化指數(shù)、乳化能力和乳化穩(wěn)定性結果

如圖9A所示，乳化指數(shù)在24 h內(nèi)變化較大，之后的乳化指數(shù)幾乎保持不變，且相同質量分數(shù)CSP的乳化指數(shù)值下降速度明顯小于CAP，這與Jiang Yang等[6]的報道結果相似。乳液的乳化能力和乳化穩(wěn)定性數(shù)值如圖9B、C 所示，CSP乳液的乳化能力和乳化穩(wěn)定性明顯高于同等質量分數(shù)的CAP，并且隨著果膠質量分數(shù)的增加，差距逐漸增大，這與乳化指數(shù)結果一致。綜合數(shù)據(jù)分析，歐李次級果中提取的果膠乳化性能明顯高于市售蘋果果膠。這可能與其體系的黏度、持水能力和空間構象有關[33]。 某些金屬離子（Ca2+、Mg2+、Zn2+等）的存在也會對果膠乳液體系產(chǎn)生積極的影響[30]。另外，與CAP相比，CSP總多酚含量較高。已有研究表明，多酚可以通過酯鍵與阿拉伯糖和半乳糖相連[34]，CSP中的羧基可以通過氫鍵和疏水作用與多酚中的酚羥基發(fā)生分子間交聯(lián)，從而形成連續(xù)相中非均相的聚集網(wǎng)絡[35]，這可能也是其優(yōu)良乳化性能的原因之一。

圖9 不同質量分數(shù)CSP和CAP的乳化指數(shù)（A）、乳化能力和 乳化穩(wěn)定性（B、C）Fig. 9 Emulsification index (A), emulsification capacity and emulsion stability (B, C) of CSP and CAP at different concentrations

2.7.3 流變學特性

如圖10所示，2 種乳液在剪切速率1～100 s－1范圍內(nèi)均表現(xiàn)出剪切變稀行為，乳液黏度隨著果膠質量分數(shù)的增加逐漸增大，CSP乳液的黏度均明顯高于CAP，且表現(xiàn)出更強的抗剪切能力，這與Zhao Shaojie等[36]研究結果一致。較大剪切力可能會導致乳液內(nèi)分子重排，增大果膠分子的空間位阻和摩擦力，從而導致表觀黏度的 增加[37]。果膠乳液的流變學特性符合乳液黏度越大，乳化指數(shù)值越高的規(guī)律，與上述實驗數(shù)據(jù)對應。

圖10 CSP和CAP的流變學性質Fig. 10 Rheological properties of emulsions stabilized by CSP or CAP at different concentrations

3 結 論

本實驗采用常規(guī)熱酸法從歐李落果和廢棄物中提取果膠，測其理化性質和結構，并對其乳化性能進行綜合分析。結果表明，CSP為高甲氧基果膠，含有更多的總多酚、金屬元素和蛋白質，CSP乳液在質量分數(shù)1.5%時具有較小的粒徑和較高的黏度、乳化指數(shù)、乳化能力、乳化穩(wěn)定性，無破乳現(xiàn)象，展現(xiàn)出較高的乳化性質。CSP的乳化性能可能與其線性結構、金屬元素及多酚的交聯(lián)作用有關。另外，較大的負Zeta電位值賦予了CSP更多的負電荷數(shù)量，使果膠乳液體系中分子間的靜電斥力增大，一定程度上阻止了分子間的絮凝和聚集。CSP乳化性質的具體機理還需進一步研究和討論。綜上所述，CSP可以作為一種新型的乳化劑，在未來具有廣闊的發(fā)展前景。