銀耳孢子凝固型酸奶制備工藝

朱涵予，陳政

（衡陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421000）

銀耳是一類具有保健功能的食用菌，富含多糖、蛋白質(zhì)、黃酮類和多種維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有極高的食用、藥用及經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。銀耳孢子較銀耳子實(shí)體相比有生長(zhǎng)周期短、易培養(yǎng)、耐貯存等優(yōu)勢(shì)[2]。銀耳孢子發(fā)酵液中的孢子多糖含量是銀耳子實(shí)體的7～8倍，且與銀耳多糖的結(jié)構(gòu)相似，功能相近，具有增強(qiáng)腸道消化能力、降低血脂、抗衰老與抗氧化、降低血糖等功效[3-4]。目前已有以多種銀耳子實(shí)體為原料的食品得到開發(fā)，如銀耳酸奶[5-6]、銀耳露酒[7]、銀耳豆奶[8]，而對(duì)銀耳孢子相關(guān)的應(yīng)用較少。

酸奶是一類以牛奶為主要原料，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵而成的一類富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、芳香物質(zhì)的飲品，在調(diào)節(jié)腸道環(huán)境、提供營(yíng)養(yǎng)以及促進(jìn)人體健康等方面都起著重要的作用[9]。目前我國(guó)所研發(fā)的酸奶功能和種類都較單一[10]，且銀耳相關(guān)酸奶產(chǎn)品主要以銀耳子實(shí)體為原料[6]，銀耳孢子酸奶在市場(chǎng)上還未有產(chǎn)品。因此，本課題將銀耳孢子作為原料添加入牛奶，經(jīng)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵制成銀耳孢子酸奶，并從銀耳孢子添加量、蔗糖添加量、乳酸菌發(fā)酵劑接種量、發(fā)酵等方面探究銀耳孢子酸奶的最佳制作工藝，為酸奶口味多樣化和實(shí)際生產(chǎn)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

銀耳孢子菌種：Y13，保存于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室；全脂奶粉、脫脂奶粉：內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司；白砂糖：長(zhǎng)沙市湘特食品有限公司；保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌：丹尼斯克（中國(guó)）公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖(PDB)培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；淀粉酶（酶活力≥1.5 U·mg－1）：河南萬(wàn)邦有限公司；氯化鈉、氨水、無(wú)水乙醇、無(wú)水乙醚、石油醚、剛果紅、鹽酸、碘、氫氧化鈉、乙醚、七水硫酸鈷、酚酞、三氯甲烷、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、對(duì)硝基苯酚、乙酸鈉、無(wú)水乙酸鈉、乙酸、甲醛、乙酰丙酮：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器

SW-CJ-ID型單人凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；THZ-C-1冷凍恒溫振蕩儀：太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；MJX-280型恒溫培養(yǎng)箱：金壇市安普實(shí)驗(yàn)儀器廠；BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；DHG-9240型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；C21-WK2102型多功能電磁爐：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；722S型可見分光光度計(jì)：上海棱光技術(shù)有限公司；AN168型電子天平：上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

銀耳孢子發(fā)酵液→水、全脂乳粉、蔗糖混合滅菌冷卻接種灌裝發(fā)酵→后熟成品

操作要點(diǎn)

（1）銀耳孢子培養(yǎng)：保存的銀耳芽孢菌種接種至PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，挑取活化的銀耳孢子接入PDB培養(yǎng)基中，25℃，115 r·min－1搖床培養(yǎng)4 d得到銀耳孢子發(fā)酵液。待搖床培養(yǎng)完成后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并稀釋至1×108CFU·mL－1，并置于121℃滅菌15 min，于4℃冰箱中冷藏備用。

（2）酸奶制作：將水倒入鍋中煮沸，加入全脂奶粉和白砂糖混合，向牛乳中加入銀耳孢子發(fā)酵液混勻并用紗布進(jìn)行過(guò)濾，再次加熱至95℃，維持10 min。待混合液冷卻至42℃左右，接入乳酸菌發(fā)酵劑，攪拌均勻后灌裝到已滅菌酸奶玻璃瓶中，于42℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵至成熟，放入4℃后熟。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）單因素實(shí)驗(yàn)

①銀耳孢子添加量的確定：在蔗糖添加量6%，發(fā)酵劑接種量0.1%，發(fā)酵溫度42℃，發(fā)酵時(shí)間9 h的條件下，將樣品分成5組，其中每組3個(gè)平行試驗(yàn)。改變銀耳孢子的添加量，在5組樣品中分別添加8%，12%，16%，20%，24%的銀耳孢子，研究銀耳孢子添加量對(duì)銀耳孢子酸奶感官品質(zhì)的影響。

②發(fā)酵劑接種量的確定：在蔗糖添加量6%，銀耳孢子添加量16%，發(fā)酵溫度42℃，發(fā)酵時(shí)間9 h的條件下，將樣品分5組，其中每組3個(gè)平行試驗(yàn)。改變發(fā)酵劑接種量，在5組樣品中分別添加0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%的乳酸菌發(fā)酵劑，研究發(fā)酵劑接種量對(duì)銀耳孢子酸奶感官品質(zhì)的影響。

③蔗糖添加量的確定：在銀耳孢子添加量16%，發(fā)酵劑接種量0.1%，發(fā)酵溫度42℃，發(fā)酵時(shí)間9 h的條件下，將樣品分成5組，其中每組3個(gè)平行試驗(yàn)。改變糖添加量，在5組樣品中分別添加5%，6%，7%，8%，9%的蔗糖，研究蔗糖添加量對(duì)銀耳孢子酸奶品質(zhì)的影響。

④發(fā)酵時(shí)間的確定：在蔗糖添加量6%，銀耳孢子添加量16%，發(fā)酵劑接種量0.1%，發(fā)酵溫度42℃的條件下，將樣品分5組，其中每組3個(gè)平行試驗(yàn)。改變發(fā)酵時(shí)間，5組樣品的發(fā)酵時(shí)間分別是8，9，10，11，12 h，研究發(fā)酵時(shí)間對(duì)銀耳孢子酸奶品質(zhì)的影響。

（2）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，將溫度控制在42℃，以銀耳孢子添加量、乳酸菌發(fā)酵劑接種量、蔗糖添加量、發(fā)酵時(shí)間作為影響銀耳孢子酸奶品質(zhì)的主要因素。在每個(gè)因素中分別選出3個(gè)較好的水平進(jìn)行正交試驗(yàn)中。

1.2.3 質(zhì)量評(píng)價(jià)

（1）感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

請(qǐng)10位具有相關(guān)經(jīng)驗(yàn)的感官評(píng)定員從色澤、氣味、滋味、組織狀態(tài)、凝乳狀態(tài)5個(gè)方面對(duì)銀耳孢子酸奶成品進(jìn)行感官分析。所得結(jié)果為每項(xiàng)分值之和，感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)如表1，感官評(píng)定表滿分為100分。

表1 感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

（2）酸奶質(zhì)量指標(biāo)的測(cè)定方法

①脂肪含量測(cè)定

采用索氏抽提法測(cè)定酸奶中脂肪含量。取充分混勻酸奶樣品10 g于抽脂瓶中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%氨水2 mL，混勻后置于65℃的水浴中加熱15 min。取出冷卻至室溫，期間不時(shí)取出振蕩。用乙醚提取酸奶樣品中的脂肪后，置于沸水浴蒸發(fā)去除乙醚，直至恒重并稱重。每組計(jì)數(shù)3次，取平均值。

②蛋白質(zhì)含量測(cè)定

依次精密吸取0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1 mL氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，分別置于10 mL比色管中。各加入乙酸鈉-乙酸緩沖溶液4 mL及顯色劑4 mL，加水稀釋至刻度，混勻，置于100℃水浴中加熱15 min。取出冷卻至室溫。將第一瓶作為空白對(duì)照，在400 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度值。以酸奶質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取1 g酸奶樣品按照以上方法測(cè)定吸光值，重復(fù)3次取平均值。

③酸度測(cè)定

準(zhǔn)確稱取4 g酸奶樣品于250 mL錐形瓶中，加入96 mL蒸餾水使酸奶樣品溶解，攪拌，靜置20 min。以酚酞作為指示劑，用0.1 mol·L-1NaOH溶液滴定，直至5 s內(nèi)顏色不消退，整個(gè)滴定過(guò)程應(yīng)在45 s內(nèi)完成。每組計(jì)數(shù)3次，取平均值。

④乳酸菌計(jì)數(shù)

稱取酸奶樣品25 g，置于無(wú)菌均質(zhì)杯中，加入無(wú)菌生理鹽水225 mL，振搖混勻并進(jìn)行梯度稀釋，選擇2~3個(gè)適宜的稀釋度，各取勻液1 mL加入到無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，涂布至MRS培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)1~2 d。每組計(jì)數(shù)3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀耳孢子添加量對(duì)酸奶感官評(píng)定的影響

在酸奶中添加銀耳孢子，增加酸奶的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的同時(shí)也影響著酸奶的風(fēng)味和組織狀態(tài)，對(duì)酸奶的品質(zhì)有著重要的影響。銀耳孢子的添加量對(duì)酸奶感官評(píng)定的影響如表2。從表2中可以看出，酸奶的感官品質(zhì)呈先上升后下降的趨勢(shì)，隨著銀耳孢子添加量的增加，銀耳的風(fēng)味越來(lái)越濃郁。當(dāng)銀耳孢子添加量為16%時(shí)，酸奶的感官評(píng)分達(dá)86分，感官品質(zhì)最好，銀耳的風(fēng)味較適宜，具有較明顯的銀耳清香味，且組織結(jié)構(gòu)和凝固狀態(tài)都較好，表面均勻、光滑，無(wú)明顯的乳清析出。當(dāng)銀耳添加量為8%時(shí)，感官評(píng)分較低，銀耳的風(fēng)味較淡，幾乎嘗不出銀耳滋味，但奶味較濃，組織狀態(tài)較好。當(dāng)銀耳添加量為12%時(shí)，可以嘗出少許銀耳滋味，但口感和氣味都不如銀耳孢子添加量為16%的酸奶好，此時(shí)銀耳孢子酸奶的感官評(píng)分為82分。而銀耳孢子添加量為20%時(shí)，銀耳味較濃，且組織狀態(tài)和凝固狀態(tài)都略遜于銀耳孢子添加量為16%的酸奶。當(dāng)銀耳孢子添加量為24%時(shí)，銀耳孢子酸奶的感官評(píng)分低至78.3分，此時(shí)酸奶的銀耳滋味過(guò)濃，風(fēng)味較差，且組織松散，凝固性差。

表2 不同銀耳孢子添加量對(duì)酸奶感官評(píng)定的影響

2.2 發(fā)酵劑接種量對(duì)酸奶感官評(píng)價(jià)的影響

發(fā)酵劑接種量在一定程度上影響著酸奶的品質(zhì)。過(guò)大的接種量可能會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵過(guò)快，使成品酸味過(guò)重，且可能會(huì)使乳清析出，使酸奶凝固性和組織狀態(tài)較差，所以接種量對(duì)酸奶的品質(zhì)有重要影響。不同的接種量對(duì)酸奶的影響見表3。從表3中可以看出，當(dāng)接種量為0.05%時(shí)，酸奶的凝固性和組織狀態(tài)都較差，風(fēng)味較淡。當(dāng)接種量為0.25%時(shí)，酸奶的凝固性和組織狀態(tài)都較差，滋味過(guò)酸，且有少量的乳清析出。當(dāng)接種量在0.1%~0.2%之間時(shí)，酸奶的風(fēng)味、組織狀態(tài)和凝固性都較好。其中接種量為0.1%時(shí)，酸奶的感官品質(zhì)達(dá)到最佳，感官評(píng)分高達(dá)90.3分。

表3 不同發(fā)酵劑接種量對(duì)酸奶感官評(píng)價(jià)的影響

2.3 蔗糖添加量對(duì)酸奶感官評(píng)價(jià)的影響

不同的蔗糖添加量對(duì)酸奶感官評(píng)定的影響如表4所示。從表4中可以看出，當(dāng)蔗糖的添加量未超過(guò)8%時(shí)，酸奶的感官品質(zhì)差別不大。當(dāng)蔗糖的添加量達(dá)到9%時(shí)，酸奶的感官評(píng)分為80.5分，酸奶的感官品質(zhì)下降明顯。蔗糖的添加量為5%時(shí)，銀耳孢子酸奶的氣味較淡，口感較差。當(dāng)添加量為6%時(shí)，酸奶偏酸。7%的蔗糖添加量，酸奶的感官評(píng)分達(dá)89.1分，酸甜比較適宜，口感較好。蔗糖的添加量為8%時(shí)，酸奶偏甜，口感較好。蔗糖的添加量為9%時(shí)，甜味過(guò)重，口感和組織狀態(tài)都較差。

表4 不同蔗糖添加量對(duì)酸奶感官評(píng)價(jià)的影響

2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸奶感官評(píng)價(jià)的影響

發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)酸奶感官評(píng)定的影響如表5所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酸奶的感官品質(zhì)呈先上升后下降的趨勢(shì)。其中發(fā)酵9 h的酸奶，酸奶的感官評(píng)分達(dá)86分，此時(shí)的酸奶凝固性較好，無(wú)乳清析出且滋味酸甜適宜。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為8 h時(shí)，發(fā)酵時(shí)間較短，風(fēng)味較淡，凝乳狀態(tài)較差，但無(wú)明顯的乳清析出。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到12 h時(shí)，酸奶的感官評(píng)分低至76.3分，發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，酸乳滋味過(guò)濃，且乳清析出嚴(yán)重，感官品質(zhì)較差。

表5 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸奶感官評(píng)價(jià)的影響

2.5 正交試驗(yàn)

為了更好確定銀耳孢子酸奶的最佳制作工藝，本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)的方法。選擇銀耳孢子發(fā)酵液添加量、發(fā)酵劑接種量、蔗糖添加量、發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素作為影響因素。根據(jù)單因素試驗(yàn)，從各因素中選出3個(gè)較好的水平做正交試驗(yàn)。三因素三水平正交試驗(yàn)見表6。

表6 正交試驗(yàn)的因素和水平

根據(jù)以上選定的因素和水平進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，結(jié)果如表7所示。從表7中可以得出銀耳孢子酸奶的最佳制作工藝為A2B2C3D1，根據(jù)極差值R得出各影響因素的影響順序應(yīng)為A＞C＞D＞B，即銀耳孢子發(fā)酵液添加量＞蔗糖的添加量＞發(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵劑接種量。由此可見銀耳孢子的添加量對(duì)酸奶感官品質(zhì)的影響最大，其次是糖的添加量。發(fā)酵劑的接種量和發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短相對(duì)來(lái)說(shuō)對(duì)酸奶的感官品質(zhì)影響較小。因此可以確定銀耳孢子酸奶的最佳工藝條件為在發(fā)酵溫度為42℃的條件下，添加8%的蔗糖，16%的銀耳孢子，接入0.15%的乳酸菌發(fā)酵劑，經(jīng)9 h發(fā)酵制成的銀耳孢子酸奶感官品質(zhì)最佳。

表7 L 9(34)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.6 酸奶質(zhì)量指標(biāo)

我們根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果所得的最佳工藝進(jìn)行酸奶的制備，并進(jìn)行酸奶相關(guān)質(zhì)量指標(biāo)的測(cè)定。測(cè)得的銀耳孢子酸奶的脂肪含量為2.7 g·100 g－1；蛋白質(zhì)含量為2.45 g·100 g－1；酸度為79°T；乳酸菌數(shù)為3.49×107CFU·g-1。根據(jù)GB 19302—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》中所規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，要求脂肪含量為≥2.5 g·100 g－1，蛋白質(zhì)含量≥2.3 g·100 g－1，酸度≥70.0°T，乳酸菌數(shù)≥1×106CFU·g－1。上述結(jié)果顯示，銀耳孢子酸奶的各項(xiàng)理化指標(biāo)及微生物指標(biāo)均符合GB 19302—2010規(guī)定的要求[9]，為合格的產(chǎn)品（見表8）。

表8 理化指標(biāo)與微生物指標(biāo)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以銀耳孢子和牛奶為原料，選用嗜熱乳酸鏈球菌和保加利亞乳桿菌1:1混合菌種作為乳酸菌發(fā)酵劑。實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)影響酸奶品質(zhì)的4個(gè)主要因素：銀耳孢子的添加量、蔗糖添加量、發(fā)酵劑接種量、發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行了探究。

（1）在研究不同銀耳孢子添加量對(duì)銀耳孢子酸奶感官評(píng)定的影響時(shí)，得出當(dāng)銀耳孢子添加量為16%時(shí)酸奶的感官品質(zhì)最佳。銀耳添加量為8%和12%時(shí)，銀耳的風(fēng)味較淡，而銀耳孢子添加量為20%和24%時(shí)，銀耳味都較濃，口感和氣味都不如銀耳孢子添加量為16%的酸奶。

（2）在研究不同的發(fā)酵劑接種量對(duì)酸奶感官評(píng)價(jià)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)接種量在0.1%~0.2%之間時(shí)，酸奶的風(fēng)味、組織狀態(tài)和凝固性都較好。其中接種量為0.1%時(shí)，酸奶的感官品質(zhì)達(dá)到最佳。當(dāng)接種量為0.05%和0.25%時(shí)，酸奶的組織狀態(tài)和凝固性都較差。

（3）在研究不同蔗糖添加量對(duì)酸奶感官評(píng)價(jià)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)蔗糖的添加量未超過(guò)8%時(shí)，酸奶的感官品質(zhì)差別不大。當(dāng)蔗糖的添加量達(dá)到9%時(shí)，酸奶的感官品質(zhì)下降明顯。蔗糖的添加量為5%時(shí)，銀耳孢子酸奶的氣味較淡，口感較差。當(dāng)添加量為6%時(shí)，酸奶偏酸，口感一般。7%的蔗糖添加量，酸甜比較適宜，口感較好。蔗糖的添加量為8%時(shí)，酸奶偏甜，口感較好。蔗糖的添加量為9%時(shí)，甜味過(guò)重，口感和組織狀態(tài)都較差。

（4）在研究發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)酸奶感官評(píng)價(jià)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵9 h的酸奶，凝固性較好，且無(wú)乳清析出，滋味酸甜適宜。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為8 h時(shí)，因發(fā)酵時(shí)間較短，風(fēng)味較淡，凝乳狀態(tài)較差，但無(wú)明顯的乳清析出。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到12 h時(shí)，發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，酸乳滋味過(guò)濃，且乳清析出嚴(yán)重，感官品質(zhì)較差。

（5）本實(shí)驗(yàn)通過(guò)正交試驗(yàn)確定了銀耳孢子酸奶的最佳制作工藝，研究表明當(dāng)糖添加量為8%，銀耳孢子添加量為16%，發(fā)酵劑接種量為0.15%，發(fā)酵溫度為42℃，發(fā)酵時(shí)間為9 h時(shí)，銀耳孢子酸奶的感官品質(zhì)最佳。且經(jīng)檢測(cè)，銀耳孢子酸奶的脂肪含量為2.7 g·100 g-1；蛋白質(zhì)含量為2.45 g·100 g-1；酸度79°T；乳酸菌數(shù)達(dá)到3.49×107CFU·g-1，均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。銀耳孢子酸奶同時(shí)具有銀耳和酸奶的營(yíng)養(yǎng)和保健功能，銀耳和牛乳達(dá)到營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)，提高了產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[11]。本實(shí)驗(yàn)為銀耳孢子風(fēng)味酸奶的研制提供了理論依據(jù)，豐富了功能性酸奶的種類，具有較好的市場(chǎng)前景。