清熱消腫止痛膏的制備及其皮膚安全性評價(jià)研究*

王雋 ，李萍 ，劉靖 ，卓虹伊 ，李維 ，宋雨

（1.成都市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，成都 610041；2.成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，成都 610106；3.成都大學(xué)醫(yī)學(xué)院，成都 610106）

清熱消腫止痛散由黃柏、大黃、黃芩、梔子、郁金、香附、甘草7味藥材組成，主要包括生物堿類、蒽醌類、苷類、環(huán)烯醚萜類等藥效學(xué)成分[1-3]，具有清熱解毒[4]、消腫止痛[5-6]、祛風(fēng)除濕[1，7]等功效，是用于緩解痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎癥導(dǎo)致的關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、活動功能障礙等癥狀的經(jīng)驗(yàn)方，具有幾十年臨床用藥經(jīng)驗(yàn)，療效極佳。然而散劑具有易結(jié)塊、品相差、微生物超標(biāo)、質(zhì)量不易控制[8]、有刺激性、吸濕性、質(zhì)量不穩(wěn)定、生物利用度低、用藥不方便、易弄臟衣物、患者順應(yīng)性差等缺點(diǎn)[9-10]，很大程度限制了其應(yīng)用。貼膏制劑具有載藥量大、藥效持久、無首過效應(yīng)、生物利用度高、對皮膚刺激性小、使用方便、患者順應(yīng)性良好等優(yōu)點(diǎn)[11]。為解決清熱消腫止痛散劑型上的不足，本研究采用現(xiàn)代制劑工藝，將清熱消腫止痛散開發(fā)為清熱消腫止痛膏，同時(shí)進(jìn)行安全性評價(jià)，以便于在臨床應(yīng)用中提高患者用藥的依從性和方便性，提高藥物生物利用度及臨床療效。

本研究采用高效液相色譜（HPLC）法，建立了同時(shí)測定鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿含量的方法[12]，結(jié)合薄層色譜（TLC）法，共同控制清熱消腫止痛膏的中間體質(zhì)量，然后基于前期單因素考察的結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道情況，篩選出對提取影響較大的因素料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間、提取次數(shù)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，以指標(biāo)成分含量和浸出物收率作為考察指標(biāo)，綜合評價(jià)優(yōu)化提取工藝[13]。進(jìn)一步，采用現(xiàn)代制劑技術(shù)，以基質(zhì)的選擇、稠膏密度的考察、外觀成型性篩選成型工藝，制備清熱消腫止痛膏。以日本大耳白兔和豚鼠為動物模型，采用單次、多次給藥和主動皮膚過敏實(shí)驗(yàn)，考察其刺激性和安全性。本研究解決了消腫止痛散劑型上的不足，并進(jìn)行了安全評價(jià)，為本品的臨床應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支持，對于提高患者用藥的依從性和用藥方便性，提高藥物的生物利用度和臨床療效提供了參考，也為醫(yī)院制劑的產(chǎn)品開發(fā)提供了思路。

1 儀器與材料

1.1 儀器 TY15電子分析天平（d=0.1 mg），北京海富達(dá)科技有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀，島津企業(yè)管理（中國）有限公司；ACS-011電子秤，上海乾峰電子儀器有限公司；SZ-3自動三重純水蒸餾器，上海滬西分析儀器廠；CPA225D電子分析天平（d=0.01 mg），德國賽多利斯公司；MH14628芬蘭雷勃連續(xù)可調(diào)移液器。

1.2 試藥 黃柏、大黃、黃芩、梔子、香附、郁金、甘草飲片均購自四川省中藥飲片有限責(zé)任公司；清熱消腫止痛膏（批號：170601、170602、170603），由四川厚生天佐藥業(yè)有限公司提供；黃柏、大黃、黃芩、梔子、香附、郁金、甘草對照藥材購自中國食品藥品檢定研究院；鹽酸小檗堿（批號：110713-201212，含量86.70%）、鹽酸黃柏堿對照品（批號：111520-200504，含量94.90%）購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈購自美國Sigma Aldrich公司，色譜純；十二烷基磺酸鈉（SDS）、乙醇、硫化鈉、2，4-二硝基氯苯購自成都科隆化工有限公司，均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 日本大耳白兔12只，雌兔與雄兔數(shù)目各半，體質(zhì)量為1.7～2.3 kg；豚鼠30只，雌鼠與雄鼠數(shù)目各半，體質(zhì)量為250～300 g。實(shí)驗(yàn)動物均購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（川）2014-028。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 中間體質(zhì)量控制方法的建立

2.1.1 高效液相色譜（HPLC）色譜條件 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，安捷倫ZORBAXSB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇∶35%乙腈水[每1 L含2 g十二烷基硫酸鈉（SDS）與 2 mL 磷酸]=54∶46；檢測波長：284 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 取鹽酸黃柏堿、鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，分別加甲醇溶解并定容，制成0.10 mg/mL的鹽酸黃柏堿和0.30 mg/mL的鹽酸小檗堿對照品儲備液。精密量取各儲備液2 mL，置10 mL容量瓶中，加流動相定容，制成黃柏堿30 μg/mL和鹽酸小檗堿60 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 按處方量稱取藥材，加入6倍量的60%乙醇溶液回流提取2次，每次提取時(shí)間為1.5 h，將兩次濾液合并，濃縮至相對密度為1.22～1.27（80℃）的浸膏。取浸膏45 mg，精密稱定，加流動相溶解并定容至10 mL容量瓶中，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

2.1.4 陰性溶液的制備 除黃柏外，其余藥材按處方量稱取后，按照“2.1.3”項(xiàng)下步驟操作，即可制得黃柏陰性樣品溶液。

2.1.5 方法學(xué)考察

2.1.5.1 專屬性考察 分別精確吸取上述制備的混合對照品、供試品及黃柏陰性樣品溶液各10 μL，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，考察專屬性。

2.1.5.2 線性與范圍 精密量取鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿對照品儲備液適量，流動相稀釋制備成濃度分 別 為 193.860 0、145.400 0、96.930 0、48.470 0、9.690 0、3.390 0 μg/mL 與 101.920 0、76.440 0、50.960 0、25.480 0、10.190 0、3.570 0 μg/mL 的系列對照品溶液。按上文中所述色譜條件分別進(jìn)行進(jìn)樣、測定，并記錄各峰面積值。以鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿濃度（μg/mL）對各自峰面積進(jìn)行線性回歸，考察線性與范圍。

2.1.5.3 精密度實(shí)驗(yàn)：取混合對照品溶液，按擬定的色譜條件進(jìn)樣，同時(shí)重復(fù)6次，考察儀器的精密度。

2.1.5.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：取浸膏，按照“2.1.3”項(xiàng)下操作平行制備供試品溶液6份，按擬定的色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣，測定鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿的含量，分別計(jì)算出RSD值，考察方法的重復(fù)性。

2.1.5.5 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)：采用加樣回收法考察方法的準(zhǔn)確度。取已知含量的浸膏22.5 mg，共9份，每3份為1組，分別加入鹽酸小檗堿126.01、222.94和339.26 μg，鹽酸黃柏堿 86.64、173.27 和 219.13 μg，按照“2.1.3”項(xiàng)下操作制備回收率溶液，進(jìn)樣、測定，計(jì)算回收率，考察方法的準(zhǔn)確度。

2.2 提取工藝

2.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 在單因素基礎(chǔ)上，篩選出對提取率影響較大的4個(gè)因素，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，以浸膏收率、鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿含量之和為評價(jià)指標(biāo)[13-14]，優(yōu)選最佳提取工藝，實(shí)驗(yàn)因素水平表見開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）。

2.2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)選的最終工藝條件操作，平行制備3批供試品，以驗(yàn)證最佳提取工藝。

2.2.3 薄層鑒別研究 采用薄層色譜法，參考《中華人民共和國藥典》相關(guān)藥材薄層鑒別方法以及相關(guān)指導(dǎo)原則，對處方中各藥材進(jìn)行鑒別，提高提取物的控制質(zhì)量。各藥材具體鑒別方式見OSID。

2.3 制劑成型工藝研究

2.3.1 稠膏密度研究 為減少產(chǎn)品批次間質(zhì)量差異，減少生產(chǎn)成本，以流動性為指標(biāo)，考察稠膏的流動性。

2.3.2 基質(zhì)材料選擇研究 通過比較橡膠膏和壓敏膠的特點(diǎn)，以粘著力、過敏性、剝離性、穩(wěn)定性和外觀等指標(biāo)結(jié)合查詢相關(guān)文獻(xiàn)選擇基質(zhì)材料[15]。

2.3.3 基質(zhì)的制備研究 實(shí)驗(yàn)取BC-1型醫(yī)用壓敏膠適量，加入不同量的乙酸乙酯混勻，制成基質(zhì)，以涂布性和乙酸乙酯揮發(fā)性為指標(biāo)，考察壓敏膠與乙酸乙酯的混合比例。

2.3.4 稠膏用量考察 基于稠膏的收率波動，以患者的舒適度和載藥量與藥效的關(guān)系為指標(biāo)，考察稠膏與基質(zhì)的用量和比例。

2.4 皮膚安全性研究 參考《中藥、天然藥物刺激性和溶血性研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》和《中藥、天然藥物免疫毒性（過敏性、光過敏反應(yīng)）研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》以及季榮進(jìn)等學(xué)者的相關(guān)研究資料來進(jìn)行[16-18]，主要進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)包括刺激性實(shí)驗(yàn)、多次給藥刺激性實(shí)驗(yàn)和主動皮膚過敏實(shí)驗(yàn)。

2.4.1 單次給藥刺激性研究 取日本大耳白兔4只，實(shí)驗(yàn)前24 h剔除背部兩側(cè)各約5 cm×10 cm大小毛發(fā)，溫水擦洗干凈備用。采用同體左、右側(cè)對照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，左側(cè)為對照組，涂抹0.5 mL生理鹽水，右側(cè)為給藥組，涂抹1 g清熱消腫止痛膏，給藥1次，使用紗布和保鮮膜包裹給藥區(qū)，并用膠帶固定。24 h后，去掉包裹材料和藥物，以溫水潔凈大耳白兔皮膚。以自然光線下給藥區(qū)域皮膚有無肉眼可見的出血點(diǎn)、水腫、紅斑為觀察指標(biāo)，以去除藥物后第1、24、48、72 h為觀察時(shí)間點(diǎn)，觀察并記錄各觀察指標(biāo)的出現(xiàn)時(shí)間和消退時(shí)間，同時(shí)記錄皮膚淺薄或皮膚粗糙情況[16]。空氣耳緣靜脈注射處死動物，取左、右側(cè)脫毛皮膚，甲醛-冰醋酸-乙醇固定液（FAA液）固定，用不同濃度乙醇梯度脫水，甲苯透明處理，石蠟包埋，5 μm 切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，記錄各樣本病理變化。

2.4.2 多次給藥刺激性研究 日本大耳白兔4只，實(shí)驗(yàn)前24 h剔除動物背部兩側(cè)各約5 cm×10 cm大小毛發(fā)，溫水擦洗干凈備用。采用同體左、右側(cè)對照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，左側(cè)為對照組，涂抹0.5 mL生理鹽水，右側(cè)為給藥組，涂抹1 g清熱消腫止痛膏，給藥7次，每日1次。使用紗布和保鮮膜包裹給藥區(qū)，并采用膠帶固定，6 h后取下包裹材料和藥物，以溫水潔凈大耳白兔皮膚。以自然光線下給藥區(qū)域有無肉眼可見的出血點(diǎn)、水腫、紅斑為觀察指標(biāo)，以每次去除藥物后 1 h、藥前和末次去除藥物后第 1、24、48、72 h為觀察點(diǎn)，觀察并記錄各觀察指標(biāo)的出現(xiàn)時(shí)間和消退時(shí)間，同時(shí)記錄皮膚淺薄或皮膚粗糙情況[16，19]。HE染色操作同“2.4.1”項(xiàng)。

2.4.3 主動皮膚過敏研究 豚鼠30只，隨機(jī)分為對照組10只、清熱消腫止痛膏組10只和2，4-二硝基氯苯組10只。實(shí)驗(yàn)之前24 h剔除豚鼠背部兩側(cè)各約3 cm×3 cm大小毛發(fā)，用溫水擦洗干凈備用。對照組豚鼠于左側(cè)去毛區(qū)皮膚上涂抹0.1 mL生理鹽水，清熱消腫止痛膏組豚鼠于左側(cè)去毛區(qū)皮膚上涂抹0.1 g清熱消腫止痛膏，2，4-二硝基氯苯組豚鼠于左側(cè)去毛區(qū)皮膚上涂抹0.1 mL 1%的2，4-二硝基氯苯，共3次致敏接觸，第7、14天同法涂抹給藥1次，醫(yī)用紗布和保鮮膜包裹，膠帶固定6 h后取下包裹材料和藥物，溫水清洗干凈。并于給藥前、第1次涂抹受試藥物后的第7、14、21、28天稱取動物質(zhì)量。于末次涂抹后14 d，在各組動物右側(cè)去毛區(qū)皮膚分別激發(fā)給藥，醫(yī)用紗布和保鮮膜包裹，膠帶固定6 h后取下包裹材料和藥物，觀察實(shí)驗(yàn)動物皮膚水腫、紅斑和其他異常反應(yīng)情況。主要過敏反應(yīng)觀察指標(biāo)為動物是否出現(xiàn)休克、哮喘、站立不穩(wěn)等嚴(yán)重的全身性過敏反應(yīng)，并于激發(fā)給藥后6、24、48和72 h觀察各指標(biāo)情況，計(jì)算過敏反應(yīng)的發(fā)生率[19]。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 中間體含量測定方法學(xué)研究 供試品溶液色譜圖中出現(xiàn)和對照品色譜圖中特征峰保留時(shí)間一致的色譜峰，黃柏陰性樣品溶液色譜圖中無特征峰。供試品溶液色譜圖中的特征峰分離度好，與相鄰峰均能有效分離，且峰形對稱，拖尾因子符合規(guī)定，理論塔板數(shù)以鹽酸小檗堿計(jì)不少于4 000，方法專屬性良好，結(jié)果見圖1。鹽酸小檗堿在3.390 0～193.860 0 μg/mL線性關(guān)系良好，鹽酸黃柏堿在3.570 0～101.920 0 μg/mL線性關(guān)系良好；儀器精密度、方法重復(fù)性、準(zhǔn)確度均符合要求，詳情見表1。

表1 方法學(xué)考察結(jié)果

3.2 提取工藝研究

3.2.1 正交實(shí)驗(yàn) 提取工藝正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析見OSID。

結(jié)果顯示，最優(yōu)提取工藝參數(shù)為料液比6∶1，乙醇濃度60%，提取次數(shù)2次，每次提取時(shí)間1.5 h。由于中藥材在提取前期藥材需浸潤，同時(shí)實(shí)驗(yàn)中每個(gè)因素對工藝沒有顯著性影響，因此綜合極差分析以及成本考慮，在第2次提取時(shí)采用5倍量溶媒提取，即加入6倍量的60%乙醇回流1.5 h，再加入5倍量的60%乙醇回流1.5 h，合并濾液即得。

3.2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 結(jié)果表明，該提取工藝能最大化提取處方中鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿的含量，且含量均一，工藝較穩(wěn)定，重復(fù)性好，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果%

3.2.3 薄層鑒別研究 結(jié)果顯示，黃柏、大黃、梔子鑒別過程中，供試品在與對照品或?qū)φ账幉南鄳?yīng)位置出現(xiàn)相同斑點(diǎn)，且陰性無斑點(diǎn)，結(jié)果見圖2?；诤繙y定和薄層鑒別實(shí)驗(yàn)共同表明該提取工藝合理，能夠最大化提取處方中各藥材的有效成分。

圖2 薄層色譜鑒別

3.3 制劑成型工藝研究

3.3.1 稠膏密度研究 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，稠膏相對密度在1.22～1.27（80℃）時(shí)不附著容器，稠膏相對密度在1.28（80℃）時(shí)雖可與基質(zhì)混合，但開始附著容器。因此，控制本品稠膏相對密度為1.22～1.27（80℃）。

3.3.2 基質(zhì)材料選擇研究 壓敏膠相較于橡膠膏，具有黏著力強(qiáng)、易剝離、穩(wěn)定、外觀佳、極少發(fā)生過敏反應(yīng)等特點(diǎn)，因此選擇BC-1型醫(yī)用壓敏膠作為基質(zhì)材料。

3.3.3 基質(zhì)的制備研究 研究結(jié)果確定BC-1型醫(yī)用壓敏膠粘劑：乙酸乙酯比例為 10∶1（g/g），此比例制備的基質(zhì)易混合均勻，易涂布，乙酸乙酯用量少，且能快速揮發(fā)完全。

3.4 皮膚安全性研究

3.4.1 單次給藥刺激性研究 結(jié)果表明，4只大耳白兔在停止給藥72 h內(nèi)均未出現(xiàn)紅斑、水腫等情況，故該批清熱消腫止痛膏單次給藥對兔皮膚未見明顯肉眼可見的刺激反應(yīng)發(fā)生，安全性良好，結(jié)果見圖3。

圖3 單次給藥刺激性實(shí)驗(yàn)HE染色結(jié)果(×100)

3.4.2 多次給藥刺激性研究 結(jié)果表明，多次給藥后4只大耳白兔在去除藥物72 h內(nèi)均未出現(xiàn)紅斑、水腫等情況，因此該批清熱消腫止痛膏多次給藥對兔皮膚無明顯肉眼可見的刺激反應(yīng)，安全性良好，詳見圖4。

圖4 多次給藥刺激性實(shí)驗(yàn)HE染色結(jié)果(×100)

3.4.3 主動皮膚過敏研究 結(jié)果表明，所有組別中的豚鼠均無休克、哮喘或站立不穩(wěn)等嚴(yán)重的全身性過敏反應(yīng)發(fā)生，體質(zhì)量無顯著增長；2，4-二硝基氯苯組激發(fā)給藥6 h后，3只豚鼠出現(xiàn)輕度紅斑，5只出現(xiàn)中度紅斑，2只出現(xiàn)嚴(yán)重紅斑，過敏反應(yīng)發(fā)生率100%；激發(fā)給藥24 h后觀察，過敏反應(yīng)的發(fā)生率達(dá)100%：發(fā)生中度紅斑4只，發(fā)生嚴(yán)重紅斑4只，發(fā)生水腫性紅斑2只；激發(fā)給藥48 h后觀察，過敏反應(yīng)的發(fā)生率達(dá)100%：發(fā)生輕度紅斑4只，發(fā)生中度紅斑2只，發(fā)生嚴(yán)重紅斑4只，發(fā)生水腫性紅斑2只；激發(fā)給藥72 h后觀察，過敏反應(yīng)的發(fā)生率達(dá)80%：紅斑情況消失2只，發(fā)生輕度紅斑2只，發(fā)生中度紅斑4只，發(fā)生嚴(yán)重紅斑2只。清熱消腫止痛膏組和生理鹽水組均無任何過敏反應(yīng)，過敏發(fā)生率為0。

4 結(jié)論

中醫(yī)認(rèn)為急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎屬于“熱痹”“歷節(jié)”“痛風(fēng)”范疇[20]，中藥治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎方法多樣，療效顯著，有獨(dú)特優(yōu)勢。其中，貼敷療法最為常見，藥物經(jīng)皮膚可直達(dá)病灶，透過性好，起效快，使用快捷，可有效避免西醫(yī)療法給患者帶來的毒副作用[21]。清熱消腫止痛散歷史悠久，在緩解關(guān)節(jié)疼痛和功能活動受限方面具有良好的臨床療效，礙于劑型的不足，極大限制了其臨床應(yīng)用。故本研究制備了清熱消腫止痛膏，解決了其劑型的不足，建立了含量測定、薄層鑒別、含膏量、耐熱性、黏附性、微生物限度等指標(biāo)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并進(jìn)行了安全性評價(jià)，保證了成品質(zhì)量和臨床療效的安全性。按本研究制備的清熱消腫止痛膏有效成分含量高，膏面光澤度好，黏附性好，皮膚殘留小，改善了原劑型藥物釋放不完全、使用不便等不足。新劑型制劑產(chǎn)品在加速實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行6個(gè)月穩(wěn)定性考察，各項(xiàng)指標(biāo)無明顯變化，表明此制備工藝科學(xué)可靠，劑型性能穩(wěn)定。

本研究基于中藥在風(fēng)濕、炎癥等領(lǐng)域的優(yōu)勢，結(jié)合現(xiàn)代制劑技術(shù)，將臨床效果較好的經(jīng)驗(yàn)方開發(fā)成制劑產(chǎn)品，提高了本品的療效，同時(shí)也為患者用藥帶來了方便，具有一定的社會效益，對于相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)具有一定的參考作用。