基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的健脾祛痰和血方治療冠心病的分子機(jī)制研究*

季康壽 ，楊茗茜 ，季小群 ，陳文娜 ，楊關(guān)林

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽 110031；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110847）

心血管疾病已經(jīng)成為全球首要的死亡原因，動脈硬化是導(dǎo)致心血管疾病最常見的病理過程，動脈粥樣硬化的核心事件是動脈內(nèi)膜的斑塊形成。冠狀動脈粥樣硬化性心臟病具有病死率高和復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)[1]，目前西醫(yī)藥物研究多集中在單靶點(diǎn)，雖然引入了組學(xué)技術(shù)，但是隨著高額科研經(jīng)費(fèi)帶來的結(jié)果產(chǎn)出率并沒有得到提升，中醫(yī)以整體觀念為指導(dǎo)思想，注重人體自身完整性及與社會、自然環(huán)境的關(guān)聯(lián)與統(tǒng)一，中藥存在多成分、多途徑、多靶點(diǎn)相互協(xié)同作用的特點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)采取系統(tǒng)性及預(yù)測性研究方法，能夠從多分子角度詮釋藥物作用機(jī)制，與中醫(yī)理論有諸多共性。課題組多中心研究顯示健脾祛痰和血方臨床治療冠心病療效顯著，此方的特點(diǎn)體現(xiàn)在“和血”，和血法更注重以藥性輕緩之藥調(diào)和痰之漸。因痰為瘀之漸、瘀為痰之至，從痰瘀的防治理論來講，在病理產(chǎn)物形成之初即采取祛瘀生新而不傷正的緩和之品，使方藥在健脾同時(shí)采用性平、微寒而入血之藥，使全方性偏柔和。但是具體的分子學(xué)機(jī)制尚未明確，本文試從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度詮釋該治法的具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 中藥成分檢索及靶點(diǎn)預(yù)測 將健脾祛痰和血方中的中藥分別輸入中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）[2]、中醫(yī)藥信息數(shù)據(jù)庫（TCMID）[3-5]、中藥潛在藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫（TCM-PTD）中，根據(jù)藥物代謝動力學(xué)及藥物效應(yīng)動力學(xué)特點(diǎn)，篩選中藥有效成分，選擇藥物口服生物利用度（OB）≥30%和藥物相似性（DL）≥0.18的化合物，然后根據(jù)chemmapper數(shù)據(jù)庫[6]進(jìn)行藥物的靶點(diǎn)預(yù)測。

1.2 冠心病靶點(diǎn)預(yù)測 選取Therapeutic Target Database（TTD）、a database of gene-disease associations（disgenet）、human phenotype ontolog（HPO）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行冠心病疾病靶點(diǎn)的檢索，取3個(gè)數(shù)據(jù)庫的并集，并在Uniprot數(shù)據(jù)庫對疾病的藥物基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，其中“term”選擇“ornganism-homo sapiens AND reviewed Yes”。

1.3 藥病共表達(dá)基因網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過上述步驟分別建立了藥物有效成分對應(yīng)的基因數(shù)據(jù)集及冠心病疾病基因數(shù)據(jù)集，因藥物有效成分與基因之間可能為多對多的關(guān)系，所以將疾病基因與藥物化合物成分對應(yīng)的基因分別輸入到venny2.1.0版本中，對各自的數(shù)據(jù)集去掉重復(fù)值，然后取兩個(gè)數(shù)據(jù)集的交集，即為藥物、疾病共表達(dá)基因，然后將基因輸入到STRING：functional protein association networks數(shù)據(jù)庫中，選擇“multiple protein”，物種選擇“homo sapiens”，調(diào)整閾值為最高，得到蛋白的相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析 在cytoscape中對網(wǎng)絡(luò)文件進(jìn)行無方向性合并，然后根據(jù)計(jì)算拓?fù)鋮?shù)，包括節(jié)點(diǎn)度、介數(shù)中心性及緊密中心性中位數(shù)選定，確定中位數(shù)以上的區(qū)間范圍，確定化合物靶點(diǎn)的緊密性連接。

1.5 生物學(xué)過程及基因通路分析 將獲得的藥物與疾病共表達(dá)基因統(tǒng)一輸入到cytoscape軟件中的“cluego”插件中，物種選擇“homo sapines”，分別選取“biological process”進(jìn)行生物學(xué)過程分析，選取Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）基因通路注釋，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異選擇P＜0.05，最后利用cytoscape建立健脾祛痰和血方的主要成分-靶點(diǎn)-信號通路的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D。

2 結(jié)果

2.1 方藥及疾病共同靶點(diǎn)預(yù)測 檢查數(shù)據(jù)庫共得到化合物861個(gè)，經(jīng)過限定內(nèi)容篩選共得到主要化合物103個(gè)，經(jīng)過ChemMapper數(shù)據(jù)庫共篩選出藥物靶點(diǎn)108個(gè)；冠心病靶點(diǎn)篩選采用TTD、disgenet、HPO數(shù)據(jù)庫，通過并集，采用Uniprot進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并篩除非人基因后共得到980個(gè)靶點(diǎn)，將兩者進(jìn)行venny2.1.0交互，得到42個(gè)病藥共同靶點(diǎn)。見圖1。

圖1 健脾祛痰和血方疾病-藥物成分靶點(diǎn)韋恩圖

2.2 共性基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選到的42個(gè)藥病共性基因輸入到string數(shù)據(jù)庫中，“minimum required interation score”選擇 0.9，選擇“hide disconnected nodes in the network”，共得到節(jié)點(diǎn)42個(gè)，邊44條，平均節(jié)點(diǎn)度為2.1。見圖2。

圖2 共同節(jié)點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 化合物及共同關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)建立 將共同靶點(diǎn)及化合物輸入到cytoscape3.2.7中，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)的可視化分析，建立方藥靶點(diǎn)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，共得到145個(gè)節(jié)點(diǎn)，圖見開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）。篩選節(jié)點(diǎn)度、介數(shù)中心性以及緊密中心性≥中位數(shù)的化合物，得到排名前8位的依次是：光果甘草寧-黃酮類、芒柄花黃素-黃酮類、光果甘草酮-黃酮類、1-methyl-8，9-dihydro-7H-naphtho[5，6-g]benzofuran-6，10，11-trione、粗毛甘草素 F、甘草寧 G、隱丹參酮II、灌木遠(yuǎn)志酮A。見表1。

表1 前8位方藥化合物

2.4 方藥中不同藥物靶點(diǎn)可視化 方藥中各藥物存在明顯的共性基因，具有共性基因的藥物能發(fā)揮協(xié)同及共同拮抗作用，通過venny2.1.0圖能夠直觀表達(dá)各個(gè)基因共性及差異性視圖化結(jié)果。圖見OSID。

2.5 藥物基因功能分析 將42個(gè)病藥共性基因輸入到cytoscape可視化軟件中，選用cluego插件中“go”功能對藥物生物學(xué)過程進(jìn)行分析，主要富集在血管直徑調(diào)節(jié)、神經(jīng)遞質(zhì)生物合成過程、類固醇激素受體活性、管徑通路生物學(xué)信息調(diào)節(jié)、長鏈脂肪酸合成過程、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長等生物學(xué)過程，另外還有眾多基因參與了一氧化氮（NO）生物過程及炎癥反應(yīng)過程，從富集分析生物學(xué)過程來看，健脾祛痰和血方能夠從神經(jīng)調(diào)控反應(yīng)、抗炎、抗氧化、擴(kuò)張血管等途徑治療冠心?。▓D見OSID）。應(yīng)用cluego中的KEGG插件分析該方藥干預(yù)疾病的主要通路，結(jié)果顯示主要涉及到的通路有VEGF信號通路、CGMP-PKG通路等。見圖3。

圖3 富集分析中信號通路注釋

2.6 建立網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D 以cytoscape軟件構(gòu)建藥物成分-靶點(diǎn)-信號通路共表達(dá)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D，見圖4。共有59個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中9個(gè)藥物主要成分，涉及到25個(gè)病藥共同靶點(diǎn)，關(guān)聯(lián)到25個(gè)相關(guān)基因通路（見表2），能夠闡明藥物主要成分、病藥共表達(dá)基因、信號通路之間的相互作用關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)分析中各個(gè)屬性節(jié)點(diǎn)之間的連接度較高，而且特征路徑的長度也較短，符合small world network理論觀點(diǎn)[7]，通過調(diào)整單靶點(diǎn)或多靶點(diǎn)即能完成對整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，這也為健脾祛痰和血方能夠多靶點(diǎn)治療冠心病的分子機(jī)制研究提供了有力證據(jù)。

3 討論

冠心病的二級預(yù)防目前仍然是西醫(yī)治療冠心病的基本原則[8]，抗血小板及他汀類藥物更是冠心病治療的基石[9]，但其不良反應(yīng)有消化道不良反應(yīng)、出血事件、抗血小板藥物抵抗，他汀類藥物則會影響肝功能、造成橫紋肌溶解等。雖然近幾年出現(xiàn)了PCSK9[10]等藥物，但是由于其費(fèi)用較為昂貴，增加了患者的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。除了以上因素，既往的藥物研發(fā)均是從單靶點(diǎn)、單途徑研究藥物對疾病的作用，具有明顯的局限性。

中醫(yī)對胸痹的認(rèn)識最早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中便有記載，認(rèn)為其屬于“胸痹”“厥心痛”范疇，主要病機(jī)為心脈痹阻。研究顯示，冠心病痰濁證的發(fā)生率正呈逐年上升趨勢[11-12]。本課題組既往采用多中心、盲法、區(qū)組隨機(jī)、平行對照臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對研究者、受試者、藥品管理人員、數(shù)據(jù)采集人員和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析人員實(shí)施盲法。同時(shí)采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件，按參加單位病例分配數(shù)和隨機(jī)比例形成隨機(jī)數(shù)字分組表，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字分組法，將受試者按1∶1比例隨機(jī)分配到試驗(yàn)組、對照組。予方劑：黃芪10 g，黨參10 g，白術(shù) 10 g，茯苓 10 g，清半夏 6 g，瓜蔞 10 g，丹參10 g，炙甘草3 g[13]。方中黨參、黃芪甘溫益氣健脾；白術(shù)甘溫兼苦燥之性，甘溫補(bǔ)氣，苦燥健脾，協(xié)黨參增益氣健脾之功；茯苓甘淡，與白術(shù)相伍，守而不走、走而不守，相輔相成；清半夏與瓜蔞相助為用，化痰散結(jié)、寬胸之功顯著；丹參性寒而緩，在益氣健脾同時(shí)能祛瘀生新而不傷正，性平和而走血分，且能避免方中溫燥之性偏盛，故稱和血之法；炙甘草調(diào)和方中諸藥，共奏方用之效。以益氣健脾、祛痰和血法干預(yù)冠心病穩(wěn)定型心絞痛（脾虛痰濁證）患者療效顯著[13]。但是其具體的分子機(jī)制，尚未見相關(guān)報(bào)道。

藥理學(xué)結(jié)果顯示，健脾祛痰和血方能夠在神經(jīng)遞質(zhì)合成過程中發(fā)揮作用，本課題組先前的研究結(jié)果也證實(shí)該方能夠降低乙酰膽堿及去甲腎上腺素水平，發(fā)揮軸性平衡調(diào)節(jié)作用；且病藥共性基因具有抗炎、抗氧化的作用，該方劑對膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）及低密度脂蛋白（LDL）有明顯的調(diào)節(jié)作用，對炎性因子指標(biāo)C反應(yīng)蛋白（CRP）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、血管細(xì)胞黏附因子-1（VCAM-1）有明顯的抑制作用[13]。雖然未見該方關(guān)于其長鏈脂肪酸合成過程、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長相關(guān)的報(bào)道結(jié)果，但是脂肪酸合酶是內(nèi)源性長鏈脂肪酸的關(guān)鍵酶，脂肪酸合酶能夠促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞對氧化低密度脂蛋折（OX-LDL）的攝取，促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成[14]，且血管內(nèi)皮生長因子能夠在抗炎、抑制心肌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管再生等方面改善內(nèi)皮功能[15]，表明健脾祛痰和血方可能在該方面發(fā)揮作用，且富集分析結(jié)果顯示在血管直徑調(diào)節(jié)、微血管功能改善等方面也有可能發(fā)揮作用，為健脾祛痰和血方治療冠心病提供新的需要驗(yàn)證的生物學(xué)過程及基因通路。雖然目前關(guān)于該治法的基礎(chǔ)研究甚少，但是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)證實(shí)該方藥能夠從多靶點(diǎn)、多途徑治療冠心病。由于以上研究是多個(gè)數(shù)據(jù)通過交叉、富集化分析的結(jié)果，途徑、通路及靶點(diǎn)情況仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。