PCSK9基因多態(tài)性與急性缺血性腦卒中患者發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及阿托伐他汀降脂作用的關(guān)系

鄒佳，潘雪，楊涌濤

(重慶市第五人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，重慶 400000)

在中國，急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke，AIS)具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率等特點(diǎn)。目前針對脂質(zhì)代謝功能障礙機(jī)制的治療，尤其是降低低密度脂蛋白(LDL)水平，可以有效改善患者預(yù)后[1]。阿托伐他汀是一種廣泛使用的降脂類藥物，具有較好的安全性和耐受性，然而AIS患者對他汀類藥物的治療反應(yīng)差異較大。全基因組關(guān)聯(lián)分析研究表明，單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)不僅與血脂水平有關(guān)，還與他汀類藥物的治療效果有關(guān)。前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/溶菌素- 9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)是近年來發(fā)現(xiàn)的影響膽固醇穩(wěn)態(tài)的主要因子，其機(jī)制可能與LDL相關(guān)受體(LDLR)的降解有關(guān)，也可能與神經(jīng)發(fā)育有關(guān)[2]。而且有研究發(fā)現(xiàn)，PCSK9編碼區(qū)的罕見突變和常見變異都可能影響血漿LDL水平和中風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)[3]。然而PCSK9 SNPs是否會影響阿托伐他汀的治療效果尚不清楚，本研究旨在分析PCSK9基因多態(tài)性檢測對阿托伐他汀降低AIS患者血脂水平作用的影響，以期為臨床精準(zhǔn)醫(yī)療提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

從我院神經(jīng)內(nèi)科招募AIS患者119例，平均年齡(61.29±12.91)歲，所有患者均于2018年6月至2020年7月期間接受治療。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) 根據(jù)臨床表現(xiàn)、腦部磁共振成像(MRI)和(或)頭顱X線計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)診斷為AIS；(2) 首次發(fā)病時(shí)間<72 h，過去2周內(nèi)無抗血小板、抗凝和溶栓治療史；(3) 有頸動脈超聲檢查和經(jīng)顱多普勒檢查數(shù)據(jù)；(4) 漢族人群，在本地居住超過10年。排除標(biāo)準(zhǔn)：有顱內(nèi)出血/中風(fēng)史，高血壓，蛛網(wǎng)膜下腔出血，腦血管畸形，惡性腫瘤，動脈瘤，腦部手術(shù)史或創(chuàng)傷史，感染性疾病，自身免疫性疾病，嚴(yán)重心臟、腎臟或肝臟疾病。有任何阿托伐他汀過敏反應(yīng)跡象的患者也被排除在外。所有患者都進(jìn)行全身檢查、缺血性腦血管事件評估、用藥史詢問，以及MRI、頸動脈超聲檢查和經(jīng)胸超聲心動圖檢查。另外納入同期在我院進(jìn)行健康體檢的120例非心腦血管疾病者作為對照組，平均年齡(61.84±11.65)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) 無已知腦血管疾病家族史；(2) 心肺檢查和神經(jīng)系統(tǒng)檢查未發(fā)現(xiàn)異常；(3) sMRI檢查排除腦血管疾病。排除合并急性或慢性感染、惡性腫瘤、自身免疫性疾病者。本研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，且患者均簽署了知情同意書。所有患者每天口服阿托伐他汀鈣片(輝瑞制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20051408，規(guī)格為每片20 mg)，每次20 mg，每天1次，共3個(gè)月。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 收集所有患者一般臨床資料包括年齡、性別、種族、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、高危因素[吸煙史(平均吸煙天數(shù)≥1 d、吸煙時(shí)間>1年定義為吸煙)、飲酒史(平均每周飲酒3次、每次超過50 g定義為飲酒)、高血壓、糖尿病、慢性阻塞性肺疾病]，以及體格檢查(身高、體重、血壓、心率、體溫)、特殊檢查(心電圖、頸動脈超聲、血常規(guī)、血糖、血脂)結(jié)果。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)室檢測 分別于治療前后采集兩組患者10 ml清晨空腹靜脈血，采用全自動生化儀檢測患者血脂包括甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL- C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL- C)、載脂蛋白A1(ApoA1)、載脂蛋白B(ApoB)水平。另外采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法(試劑盒購自上海撫生實(shí)業(yè)有限公司)檢測患者血清PCSK9水平。

1.2.3 PCSK9基因多態(tài)性檢測 抽取5 ml空腹靜脈血液樣本置于乙二胺四乙酸(EDTA)管中，3 000 r·min-1離心5 min分離血漿。用標(biāo)準(zhǔn)酚- 氯仿法從外周血白細(xì)胞中提取基因組DNA，保存在-80 ℃，然后將基因組DNA樣本稀釋到50 ng·μl-1。使用Haploview 4.2軟件和HapMap- 人類基因組單倍型圖譜數(shù)據(jù)庫，以次等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)≤0.01和連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)R2≥0.5作為閾值，篩選PCSK9基因3個(gè)SNPs基因型。采用單堿基延伸反應(yīng)法(single- base terminal extension，SNaPshot)進(jìn)行基因分型。將4.0 μl PCR產(chǎn)物與2- U堿性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase，SAP)和2- U核酸外切酶Ⅰ(exonuclease Ⅰ，ExoⅠ)在37 ℃孵育60 min。經(jīng)15 min酶滅活培養(yǎng)，將1 μl消化PCR產(chǎn)物與5 μl預(yù)反應(yīng)混合物、1 μl引物和3 μl dH2O2混合。將該混合物置于熱循環(huán)儀中，經(jīng)96 ℃ 10 s、50 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s后，加入0.5 U SAP，反應(yīng)混合物孵育60 min。加入10 μl甲酰胺并95 ℃加熱5 min后，用ABI PRISM 310型全自動DNA測序儀進(jìn)行測序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 26.0軟件處理所得數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)和重復(fù)測量的方差分析，若存在組間×?xí)r間交互效應(yīng)，則進(jìn)一步進(jìn)行單獨(dú)效應(yīng)分析；計(jì)數(shù)資料以例及百分比表示，采用卡方檢驗(yàn)；采用單因素和多因素Logistic回歸模型分析與AIS發(fā)生相關(guān)的臨床因素。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對照組與AIS組PCSK9基因型及等位基因型分布比較

如表1所示，對照組與AIS組SNP1(rs562556)、SNP2(rs2479408)、SNP3(rs529787)基因型及等位基因分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，AIS組A及C等位基因型頻率較對照組更高。

表1 對照組與AIS組SNP1(rs562556)、SNP2(rs2479408)、SNP3(rs529787)基因型及等位基因型分布比較

2.2 PCSK9基因連鎖不平衡性分析

表2顯示了PCSK9基因的連鎖不平衡模式，以及它們的|D′|和R2值。|D′|值0.7～1表示在一對SNPs之間有很強(qiáng)的LD，|D′|值0.25～0.7表示中等LD，|D′|值0～0.25表示低LD。結(jié)果顯示，SNP1和SNP2的|D′|>0.7，具有強(qiáng)LD；SNP2和SNP3的R2值>0.5意味著SNP2和SNP3可以相互替換，它們不能同時(shí)構(gòu)建單體型。SNP1和SNP2位于PCSK9基因外顯子9區(qū)域，SNP3位于內(nèi)含子3區(qū)域，因此在進(jìn)行多因素分析時(shí)只納入了SNP1和SNP2基因型。

表2 AIS組患者PCSK9基因連鎖不平衡性分析

2.3 單因素和多因素Logistic回歸分析PCSK9基因型與AIS發(fā)生的關(guān)系

經(jīng)單因素和多因素Logistic回歸分析，吸煙史、高血壓史、慢性阻塞性肺疾病史、rs562556基因多態(tài)性分布都與AIS的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)(P<0.05)，見表3。

表3 單因素和多因素Logistic回歸分析與AIS發(fā)生相關(guān)的因素

2.4 不同rs562556基因型AIS患者一般臨床資料比較

如表4所示，不同rs562556基因型的兩組(GG組與AG+AA組)患者年齡、性別、BMI、吸煙史、飲酒史、高血壓病史、糖尿病史、慢性阻塞性肺疾病史等資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 不同單倍體分型AIS患者一般臨床資料比較

2.5 不同rs562556基因型對阿托伐他汀降脂效果的影響

如表5所示，經(jīng)重復(fù)測量的方差分析，血TC、TG、LDL- C及PCSK9水平隨治療時(shí)間不斷波動變化，治療前后水平存在差異，這種波動變化可能與rs562556基因型有關(guān)。(1) 時(shí)間效應(yīng)：GG組及AG+AA組患者在不同檢測時(shí)間點(diǎn)時(shí)血TC、TG、LDL- C、PCSK9水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(2) 組間效應(yīng)：GG組與AG+AA組間血TC、TG、LDL- C、PCSK9水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(3) 組間×?xí)r間交互效應(yīng)：AG+AA組患者血TC、TG、LDL- C水平較GG組波動范圍小，而PCSK9水平波動范圍更大(P<0.05)。其他血脂指標(biāo)包括HDL- C、ApoA1、ApoB水平在整個(gè)監(jiān)測時(shí)間點(diǎn)和組間不存在交互作用(P>0.05)。單獨(dú)效應(yīng)分析顯示：治療前，AG+AA組患者血TG、LDL- C水平高于GG組患者，PCSK9水平低于GG組患者(P<0.05)；治療后，兩組血TC、TG、LDL- C水平較治療前均降低，同時(shí)PCSK9水平升高(P<0.05)；且AG+AA組患者治療后血TC、TG、LDL- C水平低于GG組，同時(shí)PCSK9水平高于GG組(P<0.05)。

表5 不同rs562556基因型對阿托伐他汀降脂效果的影響

3 討 論

PCSK9是前蛋白轉(zhuǎn)化酶家族的第9個(gè)成員[4]，作為一種絲氨酸蛋白酶和分子伴侶，PCSK9通過內(nèi)涵體/溶酶體途徑降低肝臟或肝外的LDLR水平，并增加血漿LDL- C水平，另外PCSK9還可調(diào)節(jié)ApoB的合成和分泌[5]。例如PCSK9的“功能增強(qiáng)”錯(cuò)義突變與常染色體顯性高膽固醇血癥有關(guān)，而“功能喪失”的PCSK9無義突變與低LDL- C水平及降低心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[6]。一些體內(nèi)或體外研究也證實(shí)，PCSK9編碼區(qū)的罕見突變和常見變異(如rs529787、E670G等)都會影響血漿LDL水平和AIS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[7- 8]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，SNP1(rs562556)、SNP2(rs2479408)、SNP3(rs529787)基因型及等位基因分布在AIS患者與對照組間存在差異:對SNP1(rs562556)，AIS患者A等位基因頻率高于對照組(49.16%vs39.17%，P=0.008)；對SNP2(rs2479408)和SNP3(rs529787)，AIS患者C等位基因頻率亦高于對照組。表明隨著rs562556基因A等位基因頻率的增加或rs2479408/rs529787基因C等位基因頻率的增加，AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)也相應(yīng)增加。在調(diào)整了性別、年齡、疾病史等因素后，rs562556基因多態(tài)性分布與AIS的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)，說明rs562556基因顯性模型(GGvsAG+AA)可以增加AIS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

動脈粥樣硬化是缺血性腦卒中的常見危險(xiǎn)因素之一，與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)[8]，因此降脂治療是臨床上治療或預(yù)防AIS最常用的策略。阿托伐他汀是最有效的降脂藥物之一，可降低血清TC、TG和LDL- C水平，提高血清HDL- C水平[9]。并且大量研究和臨床實(shí)踐證實(shí)，阿托伐他汀通過降低血脂水平、縮小頸動脈斑塊面積和血管狹窄程度，可顯著降低冠心病缺血性腦卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，有利于縮短AIS患者的治療時(shí)間，改善患者預(yù)后[10]。此外，梁賦等[11]發(fā)現(xiàn)，瑞舒伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀3種藥物均可有效降低大動脈粥樣硬化型覺醒型卒中患者的血脂水平，同時(shí)也會明顯提高血清PCSK9水平，這對降脂效果有一定的負(fù)面作用，因此對大動脈粥樣硬化型覺醒型卒中患者，臨床建議使用他汀類藥物聯(lián)合PCSK9抑制劑的方案，阿托伐他汀是其中一種藥效同時(shí)受遺傳因素和環(huán)境因素影響的藥物。一些薈萃分析證實(shí)，即使癥狀相似，AIS患者使用阿托伐他汀的有效性也存在差異，這表明基因多態(tài)性可能是影響藥物降脂作用的重要影響因素[12]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)阿托伐他汀治療后，AIS患者血清PSCK9水平顯著升高，而且rs562556位點(diǎn)AG+AA基因型患者血清PSCK9水平升高更明顯，同時(shí)這部分患者血脂降低程度也小于GG組患者，說明rs562556位點(diǎn)AG+AA基因型可能是影響阿托伐他汀降脂作用的重要原因。PCSK9基因外顯子9區(qū)域rs562556突變變異位于催化結(jié)構(gòu)域和C末端結(jié)構(gòu)域之間的連接結(jié)構(gòu)域，被認(rèn)為屬于功能增強(qiáng)突變[13]，其錯(cuò)義突變與頸動脈粥樣硬化斑塊、LDL- C和PCSK9水平獨(dú)立相關(guān)[14]。本研究數(shù)據(jù)也顯示，GG組患者血清PCSK9水平升高程度小于AG+AA組患者，這可能是影響阿托伐他汀降脂作用的重要原因之一。

綜上，rs562556基因顯性模型(GGvsAG+AA)可以增加漢族人群AIS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)這也可能是影響阿托伐他汀用于AIS患者降脂治療作用的重要因素，攜帶A等位基因者經(jīng)阿托伐他汀治療后血清PCSK9水平升高明顯，這對于其降脂作用有一定的負(fù)面影響。未來有待更大的樣本量來進(jìn)一步驗(yàn)證我們的發(fā)現(xiàn)。