氣相色譜法同時測定糕點中丙酸和脫氫乙酸

劉志鵬，楊李勝，王小鵬，黃敏興，余構(gòu)彬，陳其釗

1.廣東省科學(xué)院生物工程研究所（廣州 510316）；2.中國輕工業(yè)甘蔗制糖工程技術(shù)研究中心（廣州 510316）

為了延長食品的保藏期限，人們在食品加工過程中采用添加防腐劑的手段使微生物失去活性，延緩或阻止其生長。許多研究表明，丙酸和脫氫乙酸均為低毒高效的防腐劑，能通過改變膜的通透性，從而使微生物失活，對霉菌、細(xì)菌具有很好的抑制作用[1-2]。因此經(jīng)國家批準(zhǔn)兩者可作為食品添加劑用于食品防腐，多用于糕點中使用。然而長期食用添加過量的食品，容易會引起肝、腎和中免疫系統(tǒng)的損傷造成貧血和免疫功能下降[3-4]，更有研究表明，長期攝入丙酸容易引起兒童易怒、不安、注意力不集中和睡眠障礙[5]。國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定了上述兩種添加劑在糕點中的最大使用量分別為2.5 g/kg和0.5 g/kg[6]。

現(xiàn)階段丙酸和脫氫乙酸的檢測方法有：比色法[7-8]、氣相色譜法[9-12]、液相色譜法[13-16]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[17-20]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[21-22]、離子色譜法[23]。其中比色法檢出限高，不能滿足日常對低濃度樣品的準(zhǔn)確定量。質(zhì)譜法雖然靈敏度高，定性準(zhǔn)確，但前處理繁瑣，溶劑消耗大，使用成本高，不利于推廣。目前檢測食品中丙酸和脫氫乙酸的國標(biāo)方法分別是GB 5009.121—2016《食品中脫氫乙酸的測定》和GB 5009.120—2016《食品中丙酸鈉、丙酸鈣的測定》[24-25]。前者第一法為氣相色譜法，后者第一法為液相色譜法，兩者儀器不同，前處理方法也不一樣，若需要同時檢測兩種物質(zhì)，試驗操作起來費時費力。因此，開拓研究一種能同時檢測糕點中丙酸和脫氫乙酸的高效方法是國內(nèi)外食品檢測亟需解決的問題。

研究通過氣相色譜-氫火焰離子化檢測器（GCFID），系統(tǒng)考察色譜柱類型、初始溫度、沉淀劑、鹽酸加入量以及萃取溶劑種類對糕點中丙酸和脫氫乙酸提取和分離的影響，建立一種前處理簡單，靈敏度高，能夠快速、準(zhǔn)確地同時檢測兩種物質(zhì)的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗中所用到的糕點均為市場銷售產(chǎn)品；脫氫乙酸、丙酸：（純度＞99.5%），德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；七水合硫酸鋅、氫氧化鈉、鹽酸、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、乙醚、無水乙醚：分析純，廣州化學(xué)試劑廠；乙酸乙酯、正己烷、甲醇、甲苯：色譜純，美國默克公司；試驗用水均為一級用水。

Agilent 7890A氣相色譜儀：配FID檢測器，美國AgilentTechnologies公司；TLE204E電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Milli-Q超純水器，美國Millipore公司；H1850R臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；S22H超聲波清洗機，致微（廈門）儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取丙酸、脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各0.1000 g，溶于100 mL容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并定容，配制成丙酸-脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)混合儲備液（1.0 mg/mL）。

1.2.2 工作曲線的配制

分別準(zhǔn)確吸取丙酸-脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)混合儲備液0.01，0.1，0.5，1.0和2.0 mL于10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯稀釋并定容，配制成質(zhì)量濃度為1.00，10.0，50.0，100和200 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.3 樣品前處理

稱取2～4 g糕點置于50 mL的離心管中，加入約15 mL蒸餾水于離心管、2.5 mL質(zhì)量濃度為120 g/L的硫酸鋅溶液，用質(zhì)量濃度為20 g/L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.5，超聲提取15 min，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加水定容。樣液移入離心管中，以4500 r/min離心5 min。取10 mL上清液，加1 mL（1+1）鹽酸溶液酸化后，準(zhǔn)確加入5.0 mL乙酸乙酯，振搖2 min，放入離心機，以4000 r/min離心3 min，取約1 mL上清液于進(jìn)樣瓶，用氣相色譜儀測定。

1.2.4 氣相色譜條件

色譜柱：HP-FFAP（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升溫條件：初始溫度為80 ℃，始溫停留1 min，后以15 ℃/min到230 ℃保持 2 min，運行13 min后 再以3 ℃/min的升溫速度升溫至240 ℃，保留3 min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；載氣：N2（純度99.9995%），流量：1.1 mL/min（恒流模式）；隔墊吹掃流量：3 mL/min；FID檢測器溫度：300 ℃；空氣流量：400 mL/min；氫氣流量：30 mL/min；進(jìn)樣模式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Agilent7890A氣相色譜儀系統(tǒng)軟件ChemStation對樣品進(jìn)行定量定性，用Excel對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，色譜圖用Origin繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

在相同儀器條件和分析條件下，對同一濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液試驗了HP-1（30 m×0.32 mm×0.25 μm）、DB-35（30 m×0.32 mm×0.25 μm）及HP-FFAP（30 m×0.25 mm×0.25 μm）不同極性色譜柱對丙酸、脫氫乙酸的分離效果。結(jié)果表明，HP-1色譜柱無法分離出丙酸和脫氫乙酸。在DB-35色譜柱中丙酸和脫氫乙酸的響應(yīng)較小，有不同程度的拖尾，峰形對稱性較差。HPFFAP色譜柱分離丙酸和脫氫乙酸的響應(yīng)最高，峰型效果最好，與李霞等[26]的試驗結(jié)果一致。這是由于丙酸和脫氫乙酸是強極性有機酸，根據(jù)相似相溶的原理，選擇強極性色譜柱HP-FFAP分離丙酸和脫氫乙酸的效果最好。

2.1.2 程序升溫初始溫度的選擇

由于丙酸和脫氫乙酸整體響應(yīng)不高，為了提高檢出限，需要采用不分流進(jìn)樣。但較大的進(jìn)樣體積，容易產(chǎn)生溶劑效應(yīng)，會使目標(biāo)峰變寬。為了減少溶劑效應(yīng)，選擇4個較低的初始溫度進(jìn)行試驗，如圖1～圖4所示。結(jié)果表明初始溫度為50 ℃時，峰形最為尖銳，但是程序升溫時間較長，且雜峰較多；初始溫度為80 ℃時峰形依然尖銳，無拖尾，雜峰少，升溫時間較短；當(dāng)溫度升到100 ℃時，峰形較寬較矮且對稱性較差，有拖尾現(xiàn)象；初始溫度為150 ℃時響應(yīng)值最差，峰形矮胖，拖尾嚴(yán)重，同時丙酸與溶劑峰重疊，沒有實現(xiàn)基線分離。綜合考慮，程序升溫的初始溫度選80 ℃為最佳。

圖1 初始溫度為50 ℃的色譜圖

圖2 初始溫度為80 ℃的色譜圖

圖3 初始溫度為100 ℃的色譜圖

圖4 初始溫度為150 ℃的色譜圖

2.2 樣品前處理的優(yōu)化

2.2.1 沉淀劑的選擇

按1.2.1，在陰性糕點樣品中加入丙酸和脫氫乙酸混合儲備液，使得上機樣品溶液理論質(zhì)量濃度為50 mg/L，考察硫酸鋅溶液與亞鐵氰化鉀+乙酸鋅溶液兩種不同沉淀劑對試驗結(jié)果的影響。由表1可見：兩種沉淀劑對試驗結(jié)果影響的差別不大，使用硫酸鋅溶液作為沉淀劑時，脫氫乙酸的回收率要略高于亞鐵氰化鉀搭配乙酸鋅溶液作為沉淀劑時的回收率。試驗過程中觀察到使用硫酸鋅時，樣品更聚集底部，上層液更清澈。綜上，對于糕點樣品，沉淀劑宜選用硫酸鋅溶液。

表1 不同沉淀劑對丙酸和脫氫乙酸回收率的影響（n=3）

2.2.2 鹽酸溶液用量的選擇

丙酸與脫氫乙酸在食品中大多數(shù)以鈉鹽或者鈣鹽的形式存在，無法直接用氣相色譜儀檢測，因此需要在前處理過程中加入適量鹽酸使其完全轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的有機酸，從而準(zhǔn)確定量。如圖5所示：試驗結(jié)果表明，當(dāng)不加鹽酸或者加入量（0.5 mL）不夠時，丙酸與脫氫乙酸的回收率很低甚至為0，推測是因為鹽酸量不足，難以中和前處理過程中使用的氫氧化鈉，無法讓丙酸與脫氫乙酸順利酸化，而當(dāng)鹽酸加入量超過1 mL后，兩者回收率沒有隨著加入量的增加而增加。因此，為了減少無機酸對進(jìn)樣口及氣相色譜柱的損壞和減少試劑成本，選擇1 mL的鹽酸溶液加入量。

圖5 （1+1）鹽酸溶液加入量對回收率的影響

2.2.3 萃取溶劑的選擇

按1.2.1，在陰性糕點樣品中加入丙酸和脫氫乙酸混合儲備液，前處理的最后，分別選擇甲苯、乙酸乙酯、甲醇、乙醚作為萃取溶劑進(jìn)行加標(biāo)回收試驗。如圖6所示：甲苯、乙酸乙酯作為萃取溶劑時，丙酸與脫氫乙酸均有比較理想的回收率，乙醚和正庚烷則不能滿足試驗要求?？紤]試劑毒性和成本，宜選用乙酸乙酯作為方法的萃取溶劑。

圖6 不同萃取溶劑對回收率的影響

2.3 線性范圍、檢出限與定量限

將1.2.2配制好的丙酸-脫氫乙酸工作曲線進(jìn)行上機分析，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如表2所示，兩者相關(guān)系數(shù)均大于0.999，這說明丙酸與脫氫乙酸在1～200 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。以目標(biāo)峰高等于3倍基線噪音為檢出限，等于10倍基線噪音為定量限。試驗結(jié)果得出，在稱樣量為3.00 g，丙酸添加量為24 μg和78 μg以及脫氫乙酸添加量為1.8 μg和6 μg時，其對應(yīng)的信噪比分別等于3和10。因此丙酸的檢出限與定量限分別為0.008 g/kg和0.026 g/kg，脫氫乙酸的檢出限與定量限分別為0.0006 g/kg和0.0020 g/kg，均低于國標(biāo)方法，說明本方法具有一定優(yōu)越性。

表2 丙酸和脫氫乙酸的線性關(guān)系、檢出限、定量限

2.4 加標(biāo)回收率和精密度試驗

按1.2.1方法，向杏仁餅、小面包、沙琪瑪三種不同基質(zhì)樣品中分別加入三組不同水平濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率試驗和精密度試驗，結(jié)果見表3～表5。丙酸在三種樣品中的回收率和SRSD范圍分別為88.2%～92.7%和2.16%～3.88%。脫氫乙酸在三種樣品中的回收率和RSD范圍分別為96.2%～107.1%和0.92%～3.52%。能滿足日常檢驗要求。

表3 杏仁餅樣品中丙酸和脫氫乙酸的回收率及精密度（n=6）

表4 小面包樣品中丙酸和脫氫乙酸的回收率及精密度（n=6）

表5 沙琪瑪樣品中丙酸和脫氫乙酸的回收率及精密度（n=6）

2.5 方法在實際樣品檢測中的應(yīng)用以及與國標(biāo)方法的比較

將該方法運用到從市場隨機購買回來的60份樣品中進(jìn)行檢測。對比兩種物質(zhì)所對應(yīng)的不同國標(biāo)檢測方法，試驗過程中能明顯感受到該方法具有的效率優(yōu)勢，僅需要一次簡單的前處理，便能高效、準(zhǔn)確地定量出兩種防腐劑的含量。結(jié)合GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》判定，樣品的實際檢出情況為：丙酸檢出率為8.3%，不合格率為0%；脫氫乙酸的檢出率為71.7%，不合格率為1.7%。取其中一份丙酸與脫氫乙酸均為陽性的小面包樣品進(jìn)行方法與國標(biāo)方法的比較試驗，試驗結(jié)果如表6所示。由此可見，該方法與兩種國標(biāo)方法的試驗結(jié)果無顯著差異。

表6 與國標(biāo)方法的比較試驗（n=6）

3 結(jié)論

研究通過氣相色譜-氫火焰離子化檢測器（GCFID）建立了同時檢測糕點中丙酸和脫氫乙酸的方法。解決了目前檢測這兩種最為常用的防腐劑時，需要兩種大型儀器，兩種不同前處理方法的麻煩。該方法前處理簡單、安全可靠、靈敏度高、準(zhǔn)確度和精密度滿足要求，為糕點中丙酸和脫氫乙酸的檢測提供多一種選擇。