基于鉑包金的啶蟲脒間接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法的構(gòu)建

丁然，王元鳳，桑麗雅，魏新林

1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院（上海 200240）；2.上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（上海 200234）；3.杭州南開日新生物技術(shù)有限公司（杭州 311200）

啶蟲脒作為一種新煙堿類高效殺蟲劑，廣泛應(yīng)用于谷物、棉籽、蔬果、茶葉等種植。有研究顯示啶蟲脒具有一定的基因毒性及細(xì)胞毒性，會對人體神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響，或誘發(fā)DNA損傷等[1-3]。因而，有必要建立高效的啶蟲脒檢測方法。免疫學(xué)分析方法具有快速、高靈敏度、特異性強等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留的檢測中。然而，由于該方法中常用的信號標(biāo)記物辣根過氧化物酶（HRP）不穩(wěn)定、易失活，極大地限制了其在檢測中的應(yīng)用。鉑包金納米粒子是一種雙金屬納米材料，由于其較強的催化作用，可作為納米模擬酶應(yīng)用于免疫學(xué)分析，提高檢測結(jié)果的靈敏度和可靠性[4-6]。相較于鉛包金、鉑包鉛等模擬酶，鉑包金納米粒子具有更安全、產(chǎn)物精準(zhǔn)可控的優(yōu)勢。目前基于鉑包金的酶聯(lián)免疫方法多是用于檢測大分子的雙抗夾心檢測法[7-10]，其在小分子檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用仍是空白。

試驗以小分子（啶蟲脒）為目標(biāo)物，利用抗原、抗體的特異性識別體系及鉑包金納米粒子的類酶催化活性，設(shè)計一種能應(yīng)用于小分子檢測的基于鉑包金的間接競爭酶聯(lián)免疫方法。在該方法中，鉑包金納米粒子能催化氧化3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）產(chǎn)生藍(lán)色的氧化產(chǎn)物，從而實現(xiàn)定量檢測。該檢測方法填補鉑包金納米粒子在小分子酶聯(lián)免疫檢測中的空白，為其商業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

啶蟲脒標(biāo)準(zhǔn)品（源葉生物）；啶蟲脒抗原與抗體（無錫杰圣杰康生物）；羊抗小鼠IgG（上海杰一生物技術(shù)有限公司）；吐溫20、明膠、3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）（北京索萊寶公司）；其余試劑（國藥公司）。

ELISA試驗所用緩沖溶液參考姚蕾珺[1]的配方。

1.2 儀器與設(shè)備

AMR-100酶標(biāo)儀（杭州奧盛）；T6PC新世紀(jì)紫外-可見光分光光度計（北京普析通用）；微量注射泵（保定迪睿電子科技有限公司）；120 kV透射電鏡（Thermo Scientific）；電子順磁共振波譜儀（德國布魯克公司）。

1.3 方法

1.3.1 AuNPs的制備

將100 mL HAuCl4（0.01%）溶液加入到150 mL錐形瓶中，磁力攪拌器攪拌至沸，轉(zhuǎn)速150～200 r/min；保持沸騰狀態(tài)5 min后，快速加入2 mL檸檬酸鈉溶液（1.0%），繼續(xù)加熱攪拌至溶液澄清透亮且顏色不再變化，停止反應(yīng)并冷卻至室溫，于4 ℃儲藏備用。所有玻璃儀器均需在酸洗液中浸泡過夜并用超純水洗凈，轉(zhuǎn)子需在王水中浸泡過夜并用超純水洗凈。

1.3.2 Au@Pt NPs的制備

將30 mL AuNPs溶液加入到150 mL錐形瓶中，并依次加入224 μL H2PtCl6溶液（10 mmol/L）和H2O（18.656 mL）。磁力電加熱板攪拌加熱至80 ℃，轉(zhuǎn)速150～200 r/min；微量注射泵驅(qū)動注射器以0.2 mL/min緩慢加入L-抗壞血酸溶液（1.12 mL，10 mmol/L），持續(xù)加熱30 min后停止反應(yīng)，冷卻至室溫，4 ℃儲藏備用。

1.3.3 Au@Pt NPs的動力學(xué)分析

室溫（22 ℃）下依次將TMB A液（2 mL）、不同濃度TMB B液（400 μL）和Au@Pt（480 μL）溶液加入比色皿（1 cm）中，迅速混勻后用UV-Vis分光光度計監(jiān)測λ=652 nm下樣品溶液在0～300 s內(nèi)的動態(tài)吸光度變化（間隔=1 s）。利用Origin Pro 9.0軟件計算每個動態(tài)反應(yīng)曲線（不同TMB濃度）的初始斜率（SlopeInitial），根據(jù)Michaelis-Menten方程獲得非線性回歸擬合初始反應(yīng)速度v，表觀動力學(xué)參數(shù)Km及最大反應(yīng)速度Vmax，并通過方程式（1）計算催化常數(shù)Kcat[6,11]。

式中：Vmax為最大反應(yīng)速度，10-8mol/L·s；CAu@PtNPs為Au@Pt NPs濃度，10-8mol/L。

1.3.4 Au@Pt NPs-IgG制備[4]

取上述Au@Pt NPs溶液（8.5 mL），加入適量K2CO3溶液（0.1 mol/L）調(diào)節(jié)溶液pH；渦旋后加入一定濃度的羊抗小鼠IgG（0.85 mL），室溫?fù)u床震蕩1 h，37 ℃孵育12 h后，以10000 r/min離心15 min，棄上清液，將沉淀物用PBS緩沖液（pH 7.4）復(fù)溶后，再次離心取沉淀物，重復(fù)2次后用PBS緩沖液（pH 7.4）溶解至5.1 mL，于4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 ic-ELISA構(gòu)建

在酶標(biāo)板中添加包被抗原（每孔100 μL），于37℃孵育2 h，洗滌液（每孔250 μL）洗板3次，拍干；添加封閉液（每孔200 μL），于37 ℃孵育2 h，洗滌液（250 μL/孔）洗板3次，拍干；先后添加不同濃度啶蟲脒溶液（每孔50 μL）和抗體（每孔50 μL），于37 ℃孵育0.5 h，洗滌液（每孔250 μL）洗板3次，拍干；添加上述Au@Pt NPs-IgG溶液（每孔100 μL），37 ℃孵育0.5 h，洗滌液（每孔250 μL）洗板6次，拍干；加入現(xiàn)配顯色液（每孔100 μL），37 ℃孵育15 min，加入終止液（每孔50 μL）終止顯色，并用酶標(biāo)儀在λ=450 nm下測定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 AuNPs和Au@Pt NPs結(jié)構(gòu)表征

圖1（A）TEM電鏡圖顯示，AuNPs（1.18×10-9mol/L）在水溶液中為均勻分散的球形納米顆粒。圖1（B）粒徑分布圖顯示其平均粒徑為16.94±1.89 nm。以此AuNPs作為種子制備獲得Au@Pt NPs（4.15×10-10mol/L），反應(yīng)過程中觀察到溶液由酒紅色變?yōu)榧t棕色。結(jié)合圖1（C）透射電鏡圖及圖1（D）粒徑分布圖可知，Au@Pt NPs平均粒徑為18.63±2.13 nm，比AuNPs大1.69 nm，初步推測Au@Pt NPs表面沉積有鉑原子。由于金和鉑具有相似的原子質(zhì)量和晶格常數(shù)，無法通過透射電鏡清楚區(qū)分金和鉑。結(jié)合圖1（E）紫外-可見光吸收圖譜發(fā)現(xiàn)，Au@Pt NPs在508.4 nm處出現(xiàn)強局部表面等離子體共振（LSPR）峰，相較于AuNPs在519.8 nm處的LSPR峰，發(fā)生顯著藍(lán)移，這與Gao等[12]的研究結(jié)果相同。這些結(jié)果表明金納米粒子表面成功形成鉑殼。圖1（F）中單個Au@Pt NPs的中心軸方向線掃描EDX光譜進一步證明，Au@Pt NPs為鉑包金的殼核結(jié)構(gòu)。

圖1 AuNPs和Au@Pt NPs結(jié)構(gòu)表征

2.2 Au@Pt NPs類酶活性研究

通過H2O2-TMB催化模型研究Au@Pt NPs的類過氧化物酶催化活性。反應(yīng)過程中發(fā)現(xiàn)，只有TMB溶液中同時加入H2O2和Au@Pt NPs后，溶液迅速由無色變?yōu)樗{(lán)色。紫外-可見光吸收光譜分析可知，如圖2所示：[TMB+H2O2+Au@Pt NPs]反應(yīng)溶液出現(xiàn)TMB藍(lán)色氧化產(chǎn)物的特征吸收峰（λmax=651 nm）。結(jié)果證實Au@Pt NPs具有類過氧化物酶催化活性。

圖2 基于Au@Pt NPs模擬酶活性的光度分析圖譜

結(jié)合電子順磁共振EPR圖譜可進一步觀測在H2O2中加入Au@Pt NPs后H2O2產(chǎn)生的羥基自由基變化。圖3（A）顯示純化后的自由基捕獲劑DMPO沒有吸收信號，表明不存在羥基自由基。圖3（b）顯示在365 nm紫外光照下誘導(dǎo)H2O2產(chǎn)生的·OH，可被溶液中DMPO捕獲并產(chǎn)生較強的吸收信號。圖3（c）顯示：在DMPO溶液中迅速加入H2O2及Au@Pt NPs并在365 nm紫外光照誘導(dǎo)后，EPR光譜圖沒有吸收信號，表明溶液中DMPO幾乎未捕獲到·OH。這可能是由于H2O2產(chǎn)生的·OH通過其孤對電子與Au@Pt NPs的導(dǎo)帶電子之間發(fā)生交換作用，·OH被固定在Au@Pt NPs表面[13]，導(dǎo)致EPR吸收信號減弱甚至消失。不同物質(zhì)的催化效率可由親和常數(shù)（Km）與速率常數(shù)（Kcat）的比值（Kcat/Km）表示。通過動力學(xué)分析計算可得，Au@Pt NPs的催化效率Kcat/Km=104，比辣根過氧化物酶HRP的催化效率（Kcat/Km=103）高出一個數(shù)量級，表現(xiàn)出高效的類過氧化物酶催化活性。

圖3 EPR光譜圖

2.3 間接競爭 ELISA的構(gòu)建

2.3.1 Au@Pt NPs-IgG的制備與優(yōu)化

對Au@Pt NPs-IgG偶聯(lián)環(huán)境的pH、偶聯(lián)用羊抗小鼠IgG的質(zhì)量濃度及孵育時間進行優(yōu)化。

對Au@Pt NPs-IgG偶聯(lián)環(huán)境的pH進行研究。一般來說，當(dāng)反應(yīng)體系的溶液顏色與Au@Pt NPs溶液顏色一致，呈棕紅色且靜置2 h后未發(fā)生改變時，表明Au@Pt NPs-IgG狀態(tài)穩(wěn)定；反應(yīng)體系溶液由棕紅色變?yōu)樗{(lán)色時，表明Au@Pt NPs-IgG發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的聚集。研究結(jié)果顯示，在Au@Pt NPs-IgG制備體系中，1 mL Au@Pt NPs溶液中添加7 μL 0.1 mol/L K2CO3得到的偶聯(lián)物最穩(wěn)定。Au@Pt NPs在酶標(biāo)板上的高非特異性吸附易導(dǎo)致ELISA檢測結(jié)果呈假陽性，可通過增加偶聯(lián)物中IgG質(zhì)量濃度來降低檢測體系背景值（陰性孔吸光度），提高其準(zhǔn)確性。如圖4所示：IgG添加量達到0.4 mg/mL時，陰性孔/陽性孔的吸光度比值顯著降低；另外，發(fā)現(xiàn)在0.4 mg/mL IgG質(zhì)量濃度下37 ℃孵育12 h后，陰性孔/陽性孔的吸光度比值降至0.2～0.3，符合ELISA檢測的要求。綜上可得Au@Pt NPs-IgG制備的最優(yōu)條件為：1 mL Au@Pt NPs，7 μL 0.1 mol/L K2CO3，0.4 mg/mL羊抗小鼠IgG，于37 ℃孵育12 h。

圖4 偶聯(lián)用羊抗小鼠IgG的濃度優(yōu)化

2.3.2 反應(yīng)條件優(yōu)化

為提高檢測方法的靈敏度，對標(biāo)品稀釋液中的甲醇添加量、顯色液孵育時間、PBS溶液的離子強度及pH 進行優(yōu)化。圖5（A）顯示：隨著甲醇添加量增加，零標(biāo)孔吸光度逐漸變大，但抑制曲線的IC50值也隨之增大。這主要是由于甲醇增強抗原抗體間親和力的同時，也提高標(biāo)準(zhǔn)品在酶標(biāo)板上的非特異性吸附，繼而減弱抑制效果。因此，選擇不含甲醇的PBS緩沖液作為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液進行啶蟲脒間接競爭ELISA檢測體系構(gòu)建。圖5（B）顯示：隨著孵育時間增加，零標(biāo)孔吸光度變大，抑制曲線的IC50值變小。由于孵育20 min時，零標(biāo)孔吸光度在ELISA反應(yīng)的最適吸光度范圍內(nèi)，因此最優(yōu)控制顯色液孵育時間選為20 min。圖5（C）顯示：隨著離子強度增大，零標(biāo)孔吸光度發(fā)生明顯下降，但抑制效果卻顯著提升，這可能是由于離子強度增強致使抗體蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。因此，PBS緩沖液作為抗體稀釋液的最優(yōu)濃度為50 mmol/L。圖5（D）顯示：PBS緩沖液pH 8.0時，零標(biāo)孔吸光度增大，同時抑制曲線的IC50值減小，表明pH增加有助于靈敏度提升。因此，選擇pH 8.0的PBS緩沖液用于后續(xù)試驗。

圖5 反應(yīng)條件優(yōu)化

2.4 啶蟲脒標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線的建立

以啶蟲脒標(biāo)品濃度為橫坐標(biāo)，反應(yīng)溶液OD450值為縱坐標(biāo)，通過Origin 9.0軟件繪制基于鉑包金的啶蟲脒間接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。如圖6所示：該抑制曲線的回歸方程為y=0.36+1.27[1+（x/4.5）0.67]，R2=0.9955；線性檢測范圍（IC20～IC80）為0.57～35.70 ng/mL，最低檢出限（IC10）為0.167 ng/mL。

圖6 啶蟲脒標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線

2.5 交叉反應(yīng)率的測定

在標(biāo)品稀釋液中分別加入500 ng/mL的噻蟲胺、烯啶蟲胺、噻蟲嗪、啶蟲脒及吡蟲啉標(biāo)品，使用試驗建立的間接ELISA方法進行檢測。結(jié)果如圖7所示：只有加入啶蟲脒標(biāo)品時，標(biāo)品與包被原發(fā)生競爭，致使溶液在λ=450 nm處的吸光度顯著降低，說明試驗檢測方法具有良好的特異性。

圖7 試驗檢測方法對啶蟲脒的特異性

3 結(jié)論

以啶蟲脒為目標(biāo)物，基于抗原、抗體的特異性識別體系及鉑包金納米粒子的類過氧化氫酶催化活性，設(shè)計一種高靈敏度、高選擇性的間接競爭ELISA檢測方法。在該方法中，鉑包金納米粒子能催化氧化TMB產(chǎn)生藍(lán)色氧化產(chǎn)物，并在滴加終止液后于450 nm處產(chǎn)生紫外吸收峰，從而實現(xiàn)定量檢測。在最優(yōu)條件下，該方法的最低檢出限達0.167 ng/mL，線性范圍為0.57～35.70 ng/mL。