油茶樹(shù)嫩枝精油抗氧化性及抑菌性研究

張玉龍，張偉，敬思群，吳飛虎

1.韶關(guān)市友豐生態(tài)園林開(kāi)發(fā)有限公司（韶關(guān) 512005）；2.韶關(guān)學(xué)院英東食品學(xué)院（韶關(guān) 512005）；3.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（新疆 830046）

植物精油具有天然、安全、綠色、環(huán)保等優(yōu)勢(shì)，其應(yīng)用領(lǐng)域逐漸滲透到食品、制藥、康養(yǎng)等領(lǐng)域。植物精油有解熱止痛、安眠、殺菌消炎[1]、降三高[2]、防止癌癥和腫瘤[3]、增強(qiáng)免疫功能[4]、延緩衰老[5]、生物保鮮[6]等功效。對(duì)精油抑菌活性、抗氧化生物活性的研究一直是近年來(lái)研究熱點(diǎn)[6-11]。

油茶（Camellia oleifera），又名茶籽樹(shù)，是中國(guó)重要的木本油料樹(shù)種。通常在種植油茶樹(shù)的時(shí)候，剪枝是增加產(chǎn)量的一個(gè)重要方法，在春季的油茶樹(shù)剪枝，就是直接避免生長(zhǎng)素的分泌，使得結(jié)果開(kāi)花率增加，即直接將尖端的嫩枝全部剪掉，再減掉很多小枝，增加橫向吸收陽(yáng)光的面積的覆蓋率，提高結(jié)果的數(shù)量，因此會(huì)有一定量的油茶嫩枝被丟棄。油茶樹(shù)嫩枝精油又名刀煙，龍正海等[12]研究發(fā)現(xiàn)，其具有用于治療刀傷、燙傷、燒傷、急性炎癥、皮膚癌等的作用。關(guān)于油茶樹(shù)的研究主要集中于油茶籽綠色加工技術(shù)[13]、油茶籽油提取技術(shù)研究[14-15]、油茶籽油成分及品質(zhì)分析[16-18]、油茶籽油理化性質(zhì)及功效研究[19-20]，而鮮見(jiàn)油茶樹(shù)嫩枝精油的研究。

油茶樹(shù)是粵北地區(qū)特色經(jīng)濟(jì)植物，韶關(guān)重點(diǎn)發(fā)展農(nóng)作物之一，位于韶關(guān)的廣東友豐油茶科技有限公司擁有3萬(wàn)畝油茶樹(shù)園。針對(duì)大量油茶嫩枝尚未開(kāi)發(fā)利用的現(xiàn)狀，采用水蒸汽蒸餾法提取油茶樹(shù)嫩枝精油，利用氣相色譜-智譜聯(lián)用（GC-MS）分析油茶樹(shù)嫩枝精油組成成分，通過(guò)體外抗氧化模型 DPPH·自由基、ABTS+·自由基、總抗氧化能力評(píng)價(jià)精油的抗氧化活性，采用濾紙片法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，分析抑菌圈，測(cè)定最低抑菌濃度（MIC）。在為丟棄油茶嫩枝資源開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)的同時(shí)，也將變廢為寶，具有一定生態(tài)效益，并推動(dòng)韶關(guān)乃至粵北地區(qū)油茶產(chǎn)業(yè)鏈發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 主要材料試劑和儀器

油茶樹(shù)嫩枝（采集于廣東友豐油茶科技有限公司油茶基地，采摘后進(jìn)行清洗置于65 ℃干燥2 h，剪碎至1 cm左右，真空包裝待用）。

大腸桿菌（Escherichia coli，革蘭陰性菌G-）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，革蘭氏陽(yáng)性菌G+）、酵母菌（Yeast）、黑曲霉（Aspergillus niger）、根霉（Rhizopus）（韶關(guān)學(xué)院英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室）。

酵母浸膏、牛肉浸膏（上海展云化工有限公司）；瓊脂粉（北京奧博星生物技）；蛋白胨（南京茂捷生物科技有限公司）；抗壞血酸（純度99%，上海源葉生物科技有限公司）；維生素E（純度99%，浙江醫(yī)藥有限公司）；TBHQ（食品級(jí)，上海染料研究所有限公司）；1.1-二苯基-2-苦基肼（C18H12N5O6，分析純，梯希愛(ài)上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司）；2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（分析純，上海源葉生物科技有限公司）。

GT潔凈工作臺(tái)吳江和希凈化科技有限公司；Al-104電子天平（北京金科利達(dá)電子科技有限公司）；SHE-3000G酶標(biāo)儀（北京賽爾福知心科技有限公司）；SPX-250BⅢ生化培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；GCMS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）。

1.2 水蒸氣蒸餾法提取精油

油茶樹(shù)嫩枝精油地提取參考劉曉麗等[21]中水蒸氣蒸餾法，稍作改進(jìn)：稱(chēng)取一定量剪碎的油茶樹(shù)嫩枝放入蒸餾燒瓶中，蒸餾水與NaCl加入比例10∶1，加熱蒸餾，待提取器中油量不再增加時(shí)，停止加熱，冷卻后收集精油。

精油提取率計(jì)算如式（1）。

式中：E為精油提取率，%；m為油茶樹(shù)嫩枝精油質(zhì)量，g；M為油茶樹(shù)嫩枝質(zhì)量，g。

1.3 油茶樹(shù)嫩枝精油成分氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）分析

1.3.1 甲酯化處理

吸取0.3 mL油茶樹(shù)嫩枝精油于試管中，加入0.5 mL石油醚與乙醚（4∶3，V/V）混合溶液，加入0.5 moL/L氫氧化鉀-甲醇溶液0.4 mL，振蕩，靜置10～15 min。加入蒸餾水，靜置分層，取上清液進(jìn)樣分析。

1.3.2 GC條件

色譜柱DB-5毛細(xì)管柱（30 mm×0.25 mm×0.25 μm）。程序升溫：初始溫度40 ℃，保持3 min，程序升溫10 ℃/min，升溫至210 ℃，保持2 min，程序升溫5 ℃/min，升溫至280 ℃，保持3 min。進(jìn)樣口溫度280℃、柱前壓43 kPa、載氣氮?dú)狻⑦M(jìn)樣量0.5 μL、分流比20∶1，載氣流速1 mL/min。

1.3.3 MS條件

EI離子源，源溫200 ℃、電子能量70 eV、連接器溫度須230 ℃、質(zhì)量掃描范圍（m/z）30～500。按峰面積歸一化法計(jì)算各組分相去對(duì)百分含量。

1.4 油茶樹(shù)嫩枝精油抗氧化性分析

1.4.1 抗壞血酸標(biāo)品、維生素E標(biāo)品、TBHQ標(biāo)品溶液配制

分別用電子天平精密稱(chēng)取樣品10 mg，用水溶解于100 mL容量瓶中定容至100 mL（溶液為100 μg/mL），精密取上述用水稀釋配制系列質(zhì)量濃度4，8，12，16和20 μg/mL，用無(wú)水乙醇分別裝配質(zhì)量濃度為4，8，12，16和20 μg/mL的油茶樹(shù)嫩枝精油，待用。以IC50值比較抗氧化能力，IC50值表示清除率為50%時(shí)，抗氧化劑的濃度，IC50值越小，抗氧化能力越強(qiáng)。

1.4.2 DPPH·自由基清除能力分析

參考劉艷燦等[22]的作法略做改進(jìn)。以1.0 mL樣本溶液與1.0 mL濃度0.1 mmol/L DPPH·溶液，混合均勻后暗處放置30 min，無(wú)水乙醇作為參比溶液，在517 nm處測(cè)定其吸光度A，同時(shí)測(cè)定1.0 mL樣品溶液與1.0 mL無(wú)水乙醇混合后在517 nm處的吸光度A0，測(cè)定1.0 mL DPPH·溶液與1.0 mL無(wú)水乙醇混合液在517 nm處的吸光度A1，所有測(cè)定平行進(jìn)行3次取平均值，按式（2）計(jì)算其清除率。

1.4.3 ABTS+·自由基清除能力分析

參照FAN ZL等[23]方法。ABTS+·工作液配制，取5.2 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液10 mL與7.4 mmol/L ABTS+·溶液20 mL進(jìn)行混合，室溫、避光條件下放置12 h后，用無(wú)水乙醇稀釋40～50倍（A734nm=0.7±0.02），得ABTS+·工作液。將0.2 mL不同濃度樣品加入0.8 mL ABTS+工作液中，6 min后，于736 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度A。同時(shí)測(cè)定0.2 mL樣品溶液與0.8 mL無(wú)水乙醇混合液在736 nm處的吸光度A0，測(cè)定0.2 mL無(wú)水乙醇與0.8 mL ABTS+·工作液混合液在517 nm處的吸光度A1，所有測(cè)定平行進(jìn)行3次取平均值，按式（3）計(jì)算其清除率。

1.4.4 總還原力測(cè)定

利用普魯士藍(lán)法測(cè)定來(lái)油茶樹(shù)嫩枝精油的還原能力。參照J(rèn)ing等[24]方法并略做修改，取1 mL樣品溶液加入到裝有2.5 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/mL，pH=6.6）的具塞試管中，再加入2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液混合均勻，于50 ℃恒溫水浴反應(yīng)20 min，快速冷卻后，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，以4000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL水，0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻后靜置10 min，在700 nm下測(cè)吸光度（As），所有測(cè)定平行進(jìn)行3次，取平均值。根據(jù)式（4）計(jì)算吸光度

式中：A為總抗氧化能力；As為樣品吸光度；A0為空白對(duì)照。

1.5 油茶樹(shù)嫩枝精油抑菌試驗(yàn)

1.5.1 抑菌圈測(cè)定采用濾紙片法[24]

以生理鹽水作陰性對(duì)照，用0.2%山梨酸鉀溶液作陽(yáng)性對(duì)照。真菌培養(yǎng)皿放在28 ℃下培養(yǎng)48 h后進(jìn)行觀察記錄，細(xì)菌培養(yǎng)皿放在37 ℃下培養(yǎng)24 h后進(jìn)行觀察記錄。測(cè)量其抑菌圈的大小，根據(jù)抑菌圈的大小[29]判斷活性的強(qiáng)弱抑菌圈大，則表明其活性強(qiáng)，抑菌圈小則表明其活性弱。

1.5.2 最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定

將油茶樹(shù)嫩枝精油用95%乙醇分別配成含精油添加量1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%和8%溶液，取濾紙片（直徑6 mm，已滅菌）浸沒(méi)于上述配制的樣品溶液中，使其充分混勻，接于制作好的含菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)組分對(duì)測(cè)試菌種分別做2個(gè)重復(fù)，并以液態(tài)營(yíng)養(yǎng)瓊脂作為空白對(duì)照。將制好后的真菌培養(yǎng)皿在28℃恒溫培養(yǎng)48 h后觀察而細(xì)菌培養(yǎng)皿在37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察，測(cè)量其抑菌圈的大小，以最先出現(xiàn)抑菌圈的濃度為最小抑菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶樹(shù)嫩枝精油成分組成

由表1可知，以峰面積歸一化法分析各個(gè)組分的相對(duì)含量，從水蒸氣蒸餾提取的油茶樹(shù)嫩枝精油中鑒定出11種化合物，其中反-9-十八碳烯酸甲酯、棕櫚酸甲酯、α-萜品醇、芳樟醇相對(duì)含量比較高，分別為33.01%，23.13%，14.18%和12.13%。這與龍正海等[2]的報(bào)道一致，但相對(duì)含量有差異，是由于油茶樹(shù)種植地區(qū)不同而致。

圖1 油茶嫩枝精油組成的TIC圖

表1 油茶樹(shù)嫩枝精油（水蒸氣蒸餾）GC-MS分析結(jié)果

2.2 油茶樹(shù)嫩枝精油抗氧化性

2.2.1 油茶樹(shù)嫩枝精油清除DPPH·自由基能力

由圖2A可知，油茶樹(shù)嫩枝精油具有一定清除DPPH·自由基能力，精油質(zhì)量濃度20 μg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·自由基清除能力達(dá)到58%，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系。油茶樹(shù)嫩枝精油、抗壞血酸（VC）、維生素E、TBHQ對(duì)DPPH·自由基的IC50值分別為18.03±5.05 μg/mL、6.755±1.653 μg/mL、8.593±2.247 μg/mL、5.027±3.159 μg/mL；由圖2B可知，油茶樹(shù)嫩枝精油對(duì)ABTS+·自由基具有良好清除能力，在精油濃度20 μg/mL時(shí)，對(duì)ABTS+·自由基的清除能力達(dá)到67%，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系。油茶樹(shù)嫩枝精油、抗壞血酸（VC）、維生素E、TBHQ對(duì)ABTS+·自由基的IC50值分別為10.19±7.409 μg/mL、4.709±2.955 μg/mL、5.678±2.369 μg/mL、5.729±4.406 μg/mL；由圖2C可看出，油茶樹(shù)嫩枝精油的總抗氧化能力隨著質(zhì)量濃度增大而增大，與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)關(guān)系。質(zhì)量濃度20 μg/mL時(shí)，油茶樹(shù)嫩枝精油、抗壞血酸（VC）、維生素E、TBHQ的吸光度值分別為0.291，1.800，1.722和1.719，吸光度越大，其抗氧化能力越強(qiáng)，所以相對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照，精油的總抗氧化能力較弱。

圖2 油茶樹(shù)嫩枝精油抗氧化能力

2.3 油茶樹(shù)嫩枝精油抑菌性

2.3.1 抑菌圈分析

由表2可以看出，油茶樹(shù)嫩枝精油對(duì)所試菌均有抑制作用，以對(duì)細(xì)菌的抑制作用較強(qiáng)，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌（金黃色葡萄球菌）、革蘭陰性菌（大腸桿菌）都有較好的抑制作，其次是酵母菌，對(duì)霉菌抑制作用最弱。

表2 油茶樹(shù)嫩枝精油的抑菌作用

2.3.2 油茶樹(shù)嫩枝精油對(duì)細(xì)菌，真菌和霉菌的最低抑菌濃度

由表3可通過(guò)看出油茶樹(shù)嫩枝精油對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度（MIC）值為4%，對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值為5%，對(duì)革蘭陰性菌的抑菌效果優(yōu)于革蘭陽(yáng)性菌。油茶樹(shù)嫩枝精油對(duì)酵母菌的MIC值為6%，而對(duì)黑曲霉與根霉的MIC值為8%，說(shuō)明油茶樹(shù)嫩枝精油對(duì)細(xì)菌的抑制作用要強(qiáng)于對(duì)真菌與霉菌的，且對(duì)大腸桿菌抑制效果最強(qiáng)。

表3 油茶樹(shù)嫩枝精油的最小抑菌濃度試驗(yàn)結(jié)果

2.3.3 分析比較

將油茶樹(shù)嫩枝精油的抑菌性與肉桂精油通過(guò)及黃花忍冬果精油抑菌性做比較，見(jiàn)表4。

由表4抑菌圈直徑可以看出，油茶樹(shù)嫩枝精油對(duì)細(xì)菌的抑菌作用強(qiáng)于黃花忍冬果精油，但弱于肉桂精油去對(duì)細(xì)菌的抑菌性，相去對(duì)來(lái)說(shuō)是一種抑菌效果較好的廣譜抑菌劑；從最小抑菌濃度來(lái)看，油茶樹(shù)嫩枝精油對(duì)細(xì)菌、霉菌的最小抑菌濃度均比黃花忍冬果精油小，但比肉桂精油略大。

表4 3種精油的抑菌效果比較分析

3 結(jié)論

水蒸氣蒸餾法提取油茶樹(shù)嫩枝精油的提取率為0.045%；油茶樹(shù)嫩枝精油經(jīng)GC-MS分析，從水蒸氣蒸餾提取的油茶樹(shù)嫩枝精油中鑒定出11種化合物，其中反-9-十八碳烯酸甲酯、棕櫚酸甲酯、α-萜品醇、芳樟醇相去對(duì)含量比較高，分別為33.01%，23.13%，14.18%和12.13%。

油茶樹(shù)嫩枝精油具有良好的體外抗氧化能力，可作為一種新型的天然的抗氧化劑。油茶樹(shù)嫩枝精油、抗壞血酸（VC）、維生素E、TBHQ對(duì)DPPH·自由基清除能力IC50值分別為18.03±5.05 μg/mL、6.755±1.653 μg/mL、8.593±2.247 μg/mL、5.027±3.159 μg/mL，對(duì)ABTS+·自由基清除能力IC50值分別為10.19±7.409 μg/mL、4.709±2.955 μg/mL、5.678±2.369 μg/mL、5.729±4.406 μg/mL，并呈劑量關(guān)系；油茶樹(shù)嫩枝精油總抗氧化能力與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，質(zhì)量濃度20 μg/mL油茶樹(shù)嫩枝精油、抗壞血酸、維生素TBHQ的總抗氧化能力用吸光度表示分別為0.291，1.800，1.722和1.719。油茶樹(shù)嫩枝精油具有一定抗氧化活性。

油茶樹(shù)嫩枝精油對(duì)大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，酵母菌，根霉和黑曲霉均有抑制作用。油茶樹(shù)嫩枝精油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌、根霉及黑曲霉的抑菌圈分別為14.1±0.2 mm、11.1±0.1 mm、9.7±0.5 mm、6.4±0.5 mm、6.6±0.4 mm；對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度（MIC）值為4%，對(duì)金黃色葡萄球菌，根霉，酵母菌和黑曲霉的MIC值分別為5%，8%，6%和8%。油茶樹(shù)嫩枝精油對(duì)大腸桿菌的抑制作用最強(qiáng)。