金櫻子天然硒多糖的結構表征及其體外活性

劉學貴，張雪，邁德，高品一，李丹琦,

1.沈陽化工大學功能分子研究所（沈陽 110142）；2.沈陽化工大學制藥與生物工程學院（沈陽 110142）；3.沈陽化工大學國際教育學院學院（沈陽 110142）；4.硼鎂資源開發(fā)與精細化工技術國家地方聯(lián)合工程實驗室（沈陽 110142）；5.遼寧省綠色功能分子設計與開發(fā)重點實驗室（沈陽 110142）

金櫻子（Rosa laevigataMichx.）為薔薇科常綠蔓性灌木[1]，富含多糖類、黃酮類、三萜類及其衍生物等有效成分。其中，金櫻子果實中多糖含量最為豐富，現(xiàn)代藥理研究表明，金櫻子果實多糖具有抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、抗病毒和調(diào)節(jié)免疫等功能。近年來，金櫻子多糖的功能性研究成為科研工作者關注的熱點[4]。

硒是人體所必需的微量營養(yǎng)元素，可以增強機體的抗氧化能力，抵御相關疾病的發(fā)生。中國是一個缺硒大國[5]，開發(fā)高效的天然硒食品具有重要意義[6]。天然硒多糖具有毒性低、生物功效好等特點，越來越受到關注。天然硒多糖不僅具有高免疫活性和良好的生物相容性，而且可以提高硒元素的生物利用度，發(fā)揮硒的功能性作用[7]。Huang等[8]的研究發(fā)現(xiàn)灰樹花植物中天然硒多糖的生物活性通常高于硒和天然多糖，且更容易被人體吸收利用；Gu等[9]研究結果表明，茶葉中天然硒多糖SeTPS-1和SeTPS-2均表現(xiàn)出良好的抗氧化能力和對H2O2誘導的DNA損傷的保護作用；還有研究者發(fā)現(xiàn)水稻胚芽硒多糖對小鼠具有極低的毒性和較高的生物吸收能力。同時，其體外抗氧化活性試驗結果表明，水稻胚芽硒多糖清除羥基、DPPH和超氧自由基的能力高于天然多糖[10]。

試驗以金櫻子果實為原料，使用熱水法提取多糖，酶解法聯(lián)合Sevage法去除蛋白，分離純化得到一個新的天然硒多糖（Se-RLFP-1-1），通過傅立葉變換紅外光譜、核磁共振光譜、高效液相色譜等對天然硒多糖的結構特征進行表征分析；研究天然硒多糖的體外抗氧化活性和神經(jīng)保護活性，結果表明該天然硒多糖具有明顯的抗氧化活性和神經(jīng)保護活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金櫻子（來源于安徽省亳州市）；乙醇、正丁醇、二氯甲烷、濃硫酸、高氯酸、硒標準溶液等均為國產(chǎn)分析純試劑；葡萄糖（Glu）、半乳糖（Gal）、甘露糖（Man）、阿拉伯糖（Ara）等標準品（北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司）；1.1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），2,2’-聯(lián)氮基雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS），牛血清蛋白，MTT（中國生物化學試劑科學與技術公司）；SH-SY5Y細胞（中國科學院干細胞庫）。

1.2 儀器和設備

UV分光光度計（UV-2550）、示差折光檢測器RID-20A（日本島津有限責任公司）；Rotavapor R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司）；雙道原子熒光光譜儀（北京金索坤技術開發(fā)有限公司）；傅立葉變換紅外分光光度計（美國ThermoNicole公司）；酶標儀（美國Bio-Rad Laboratories公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 粗多糖的制備

取200 g干燥的金櫻子果實，將其粉碎后通過0.425 mm孔徑篩，加入20倍體積的石油醚加熱提取3次，每次1 h，除去脂溶性物質(zhì)，其殘余物留用。稱取適量殘余物，加熱回流提取3次，用4倍體積的乙醇，每次2 h，除去單糖和皂苷等小分子，剩余濾渣烘干待用。準確稱取一定量的濾渣，按照料液比1∶50（g/mL）加入蒸餾水，熱回流3次，每次1 h，收集濃縮提取液，得到粗提物。用酶解法+3次Sevage法聯(lián)合[11]去除蛋白，最后放置于50 ℃烘箱中干燥得到粗多糖。

1.3.2 粗多糖的分離純化

稱取200 mg粗多糖樣品，加入適量的蒸餾水溶解，上樣到大孔樹脂柱，掛柱12 h。以蒸餾水作為流動相進行洗脫，收集洗脫液，濃縮后使用透析膜（3500 Da）透析24 h后，將溶液過0.45 μm濾膜，上樣到DEAE-52纖維素柱，依次用蒸餾水及0.1 mol/L、0.2 mol/L NaCl 溶液洗脫，每個梯度洗脫體積500 mL左右，使用試管收集洗脫液（每管10 mL，流速0.8 mL/min），采用苯酚-硫酸法[12]在490 nm波長下測定洗脫液的吸光度，繪制洗脫管數(shù)與吸光度之間的關系曲線，收集單一對稱峰形對應的管數(shù)。收集的洗脫液經(jīng)減壓濃縮，裝入1000 Da透析袋中透析除去NaCl和小分子化合物，得到樣品。選取一定量收集的樣品于Sephadex G-200凝膠柱中，用蒸餾水洗脫樣品，收集洗脫液（每管10 mL，流速0.5 mL/min），按1.3.2方法進行檢測，收集樣品凍干后得到純化后的天然多糖。

1.3.3 天然多糖的理化性質(zhì)測定

采用苯酚-硫酸法[12]測定多糖含量。以葡萄糖為標準品，用蒸餾水配制成0.01，0.02，0.03，0.04和0.05 mg/mL葡萄糖標準溶液，以吸光度y為縱坐標，以葡萄糖質(zhì)量濃度x為橫坐標，得到標準回歸方程y=11.9x-0.011（R2=0.9952），線性范圍為0.01～0.05 mg/mL，根據(jù)標準回歸方程，進一步計算多糖含量，如式（1）所示。

采用考馬斯亮藍法[13]測定粗多糖的蛋白含量。以牛血清蛋白為標準品，取0.20，0.40，0.60，0.80和1.00 mL標準牛血清白蛋白溶液于試管中，以吸光度y為縱坐標，以蛋白質(zhì)量濃度x為橫坐標，得出標準回歸方程y=6.42x+1.0058（R2=0.9969），線性范圍為0.20～1.00 mg/mL，根據(jù)標準回歸方程，進一步計算蛋白含量，計算如式（2）所示。

1.3.4 天然多糖的硒含量測定

稱取5 mg天然多糖樣品于錐形瓶中，加入混合消解液（濃硝酸10 mL、高氯酸4 mL），室溫下反應18 h。在180 ℃條件下消化，待溶液呈現(xiàn)無色或微黃色時，加入10 mL的鹽酸繼續(xù)消化，溶液剩余1 mL左右，停止反應進行冷卻，同時做1組空白試驗。在溶液中繼續(xù)加入10 mL鹽酸和19.5 mL蒸餾水稀釋（使比色管中鹽酸濃度10%），對天然多糖進行硒含量檢測。

標準曲線的配制：取2.5 mL硒標準溶液（100 μg/mL）用10%鹽酸配成0.1 g/mL儲備液。將儲備液配制成不同質(zhì)量濃度的硒標準溶液（0，5，10，20和40 ng/mL）。

試驗條件：燈電流80 mA；負高壓-380 V；主氣流量600 mL/min；主泵流速100 r/min；采樣延時12 s；積分時間5 s。

1.3.5 天然硒多糖的分子量測定

稱取葡聚糖標準品（T4，T10，T20，T40，T200和T500），分別用純凈水制成10 mg/mL標準品溶液，過濾膜進示差液相，記錄每個色譜峰的保留時間，以出峰時間為橫坐標，標準葡聚糖的分子量對數(shù)（lgMr）為縱坐標，繪制標準曲線方程；將天然硒多糖樣品配制成10 mg/mL溶液，過濾膜后進液相色譜，將樣品保留時間帶入標準曲線得出其相對分子質(zhì)量。

色譜條件：A TSK gel G5000PW column（I.D.=7.5 mm，L=300 mm）；流動相為0.02 mol/L KH2PO4；流速0.6 mL/min；進樣量40 μL。

1.3.6 天然硒多糖的單糖組成測定

配制標準單糖混標溶液（葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露糖等），各取5 mg混合，用1 mL（V乙腈∶V水=82∶18）溶解，配制成5 mg/mL混合標準溶液，過0.22 μm有機濾頭待用。根據(jù)標準品單糖的色譜圖來確定待測多糖樣品中的單糖組成。

采用酸水解方法[14]確定單糖組成。稱取20 mg天然硒多糖（Se-RLFP-1-1），用10 mL 4 mol/L三氟乙酸溶解，在110 ℃油浴條件下反應6 h；于50 ℃旋蒸，少量多次加入甲醇帶走殘留的三氟乙酸，過濾后進行液相色譜分析。

色譜條件：sugar column（I.D.=4.6 mm，L=250 mm）；流動相為V乙腈∶V水=82∶18；流速0.4 mL/min；進樣量50 μL。

1.3.7 天然硒多糖的紅外光譜測定

取3.0 mg干燥的天然硒多糖樣品和適量干燥KBr粉末，一起放于瑪瑙研缽中，研磨并混合后壓片，多糖的紅外光譜測定在4000～500 cm-1掃描范圍內(nèi)進行[8]。

1.3.8 天然硒多糖的核磁共振波譜測定

準確稱取30 mg天然硒多糖樣品加入1 mL D2O（重水）充分溶解后，裝入核磁管中，在25 ℃下測定其1H-NMR和13C-NMR。

1.3.9 天然硒多糖的體外活性

1.3.9.1 DPPH自由基清除試驗[8]

將待測多糖樣品和VC標準品配制成不同質(zhì)量濃度（0.005，0.020，0.080，0.300，0.800，2.000和5.000 mg/mL）的溶液，依次加入0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液，在室溫下避光反應30 min，在517 nm波長下測定不同濃度溶液的吸光度，以VC溶液為陽性對照，每個濃度做3組平行試驗，DPPH自由基清除率（R）按式（3）計算。

式中：A0為無水乙醇+DPPH乙醇溶液的吸光度；A1為待測樣品+DPPH乙醇溶液的吸光度；A2為待測樣品+無水乙醇的吸光度。

1.3.9.2 ABTS自由基清除試驗[9]

將待測多糖樣品和VC標準品配制成不同質(zhì)量濃度（0.005，0.020，0.080，0.300，0.800，2.000和5.000 mg/mL）的溶液，按順序依次加入一定量的7 mmol/L的ABTS工作液，混合完全后，在室溫下避光反應10 min，在734 nm波長處檢測吸光度，以VC溶液為陽性對照，每個濃度做3組平行試驗，ABTS自由基清除率（R）按式（4）計算。

式中：A0為無水乙醇+ABTS溶液的吸光度；A1為待測樣品+ABTS溶液的吸光度；A2為待測樣品+無水乙醇的吸光度。

1.3.9.3 神經(jīng)細胞保護活性

采用MTT方法進行檢測[15]。取對數(shù)生長的SH-SY5Y細胞，加入50 μL 850 μmol/L H2O2溶液損傷細胞，作用1 h后，樣品組加入不同濃度的多糖溶液（25，50和100 μmol/L），作用4 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，置于培養(yǎng)箱孵育4 h；每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO）溶液，輕微振蕩10 min，使結晶充分溶解。在490 nm波長下測吸光度，以維生素E溶液為陽性對照，重復每組試驗3次，神經(jīng)細胞保護活性存活率R（%）按式（5）計算。

式中：A空白對照為基礎培養(yǎng)基+H2O2+MTT+DMSO的吸光度；A陽性對照為SH-SY5Y細胞+H2O2+MTT+DMSO的吸光度；A給藥組為SH-SY5Y細胞+樣品+H2O2+MTT+DMSO的吸光度。

2 結果與分析

2.1 多糖的分離與純化

金櫻子果實經(jīng)石油醚除脂、乙醇除去皂苷小分子、除色素、去蛋白、透析烘干等步驟后，得到粗多糖。粗多糖通過DEAE-52纖維素柱分離，以0，0.1，0.2，0.3和0.5 mol/L NaCl溶液洗脫；其中用0.2 mol/L NaCl洗脫時得出1個明顯主峰，見圖1（a），命名為Se-RLFP-1。Se-RLFP-1繼續(xù)使用凝膠G-200進行純化，見圖1（b），得到單一的洗脫峰，收集、透析、濃縮和凍干后得到淡黃色粉末，命名為Se-RLFP-1-1。

圖1 DEAE-52纖維素柱（a）洗脫曲線和Sephadex G-200凝膠柱（b）洗脫曲線

2.2 粗多糖的理化性質(zhì)分析

2.2.1 多糖含量的測定

依據(jù)1.3.3苯酚-硫酸法測定粗多糖中的糖含量，多糖含量為82.32%；測定純天然硒多糖（Se-RLFP-1-1），多糖含量為86.23%。

2.2.2 多糖的蛋白測定

依據(jù)1.3.3考馬斯亮藍法測定粗多糖中的蛋白質(zhì)含量，使用酶解法+3次Sevage法后測定的蛋白含量基本穩(wěn)定在0.56%，如圖2所示。

圖2 蛋白含量與Sevage法的次數(shù)的相關曲線

2.3 天然多糖的硒含量測定

依據(jù)1.3.4方法，得到的標準曲線回歸方程為y=39.9675x+120.0875（R2=0.9990）式中，x為濃度（ng/mL），y為熒光強度；計算得到Se-RLFP-1-1的硒含量為19.72 μg/g。

2.4 天然硒多糖的分子量及其單糖組成

如表1所示：根據(jù)1.3.5繪制的標準曲線方程為lgMw=-0.53506RT+12.9917（R2=0.9948），Se-RLFP-1-1進入液相，出峰時間為15.998 min，相對分子質(zhì)量為27.0 kDa。

表1 標準葡聚糖出峰時間

如圖3（a）所示：在色譜條件下對7種標準單糖混合物進行分離。如表2所示，將每種單糖的出峰時間和峰面積繪制為每種單糖的標準曲線，所測試的7個單糖標準品的峰面積與標準品的濃度具有良好線性關系，并且擬合度很高。Se-RLFP-1-1根據(jù)1.3.6色譜條件下測定，結果見圖3（b），Se-RLFP-1-1的單糖組成為鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖，其摩爾比為0.13∶0.49∶0.05∶0.34。

表2 單糖的標準曲線方程

圖3 7種單糖標準品混合物的高效液相色譜圖（a）及Se-RLFP-1-1的高效液相色譜圖（b）

2.5 天然硒多糖的紅外圖譜分析

如圖4所示：Se-RLFP-1-1的紅外光譜圖具有多糖類物質(zhì)的典型特征吸收峰[7]，在3423 cm-1處的吸收寬峰歸屬于O—H伸縮振動[16]，在2926 cm-1處的峰值被歸屬于鼠李糖甲基的C—H對稱伸縮振動引起的[17]，在1631 cm-1處的吸收峰歸屬于Se-RLFP-1-1的結合水（H—O—H）伸縮振動[18]，在1419 cm-1處的峰值為多糖的CH2剪切振動和彎曲振動引起[19]，在1230 cm-1處為C—O—C或C—O的伸縮振動吸收峰。在843 cm-1附近的吸收峰是α-糖苷鍵的特征吸收峰[20]，這個吸收峰出現(xiàn)在539 cm-1處，是由于Se—O—C或Se—OH非對稱拉伸振動導致的，表明硒元素與多糖上的—OH相連[21]。

圖4 Se-RLFP-1-1紅外光譜圖

2.6 天然硒多糖的核磁共振譜圖分析

在圖5（a）中，在δ1.18和1.24 ppm處的信號代表Se-RLFP-1-1中鼠李糖甲基的存在[22]。信號在δ1.98 ppm處為乙?；|(zhì)子信號[23]。δ3.27～4.10 ppm的信號范圍代表糖苷環(huán)上的H-2到H-5（或H-6）質(zhì)子信號[24]。在多糖的氫譜中，化學位移δ5～6 ppm為α端基質(zhì)子信號，δ4.4～5 ppm為β端基質(zhì)子信號[25]。在Se-RLFP-1-1的1H譜中，δ5.10和5.13 ppm分別為甘露糖和鼠李糖的的α端基質(zhì)子信號，δ4.44和4.45 ppm分別為半乳糖和木糖β端基質(zhì)子信號[26]。

在圖5（b）中，端基碳原子信號出現(xiàn)在δ90～110 ppm，非端基碳原子信號出現(xiàn)在δ60～85 ppm。高場區(qū)的δ21.9 ppm為鼠李糖的甲基信號。δ65.8～83.4 ppm為Se-RLFP-1-1中其他連氧碳信號，由于糖殘基中C-2到C-6的共振引起[27]。

圖5 Se-RLFP-1-1的1H NMR譜圖（a）和13C NMR譜圖（b）

2.7 天然硒多糖的體外活性

2.7.1 DPPH清除自由基試驗

如圖6所示，Se-RLFP-1-1對DPPH自由基的清除能力隨濃度增加而逐漸升高。結果表明，Se-RLFP-1-1清除DPPH自由基的IC50值為0.0612 mg/mL；在0.005～0.3 mg/mL濃度范圍內(nèi)的自由基清除力較低，可能是多糖中供氫能力減弱導致DPPH自由基結合較少，影響其抗氧化活性[28]。在0.8～5 mg/mL范圍內(nèi)自由基清除能力有較大幅度升高，特別在5.0 mg/mL濃度下，Se-RLFP-1-1的清除率達到84.96%，說明該天然硒多糖具有明顯的DPPH自由基的清除能力。

圖6 VC和Se-RLFP-1-1對DPPH自由基的清除能力

2.7.2 ABTS清除自由基試驗

如圖7所示：Se-RLFP-1-1對ABTS自由基有清除能力隨濃度增加而升高，說明其具有一定的ABTS清除自由基能力；濃度達到最大值時，Se-RLFP-1-1多糖的清除能力同時也達到最大值，且質(zhì)量濃度0.08～0.8 mg/mL時清除率逐漸趨于穩(wěn)定，說明H原子轉(zhuǎn)移的自由基淬滅或通過單電子轉(zhuǎn)移的還原，對穩(wěn)定自由基ABTS產(chǎn)生清除能力較為穩(wěn)定[29]。

圖7 VC和Se-RLFP-1-1對ABTS自由基的清除能力

2.7.3 神經(jīng)細胞保護活性

如圖8所示：與空白組細胞相比細胞存活率為100%，SH-SY5Y細胞經(jīng)H2O2處理后的模型組細胞存活率降低至62%；多糖對SH-SY5Y細胞的保護活性隨著樣品濃度增加而增加；濃度為最大100 μmol/L時，神經(jīng)保護活性為84%，明顯高于陽性對照組（維生素E）77.75%，同時在其他濃度下也都高于陽性對照（維生素E），說明該天然硒多糖具有顯著的神經(jīng)細胞保護活性作用。

圖8 Se-RLFP-1-1對H2O2誘導的SH-SY5Y細胞神經(jīng)保護活性

3 結論

從金櫻子果實中提純到一個新的天然硒多糖（Se-RLFP-1-1），通過原子熒光光譜儀測出Se-RLFP-1-1的硒含量為19.72 μg/g。其單糖組成和摩爾比為鼠李糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖=0.13∶0.49∶0.05∶0.34。該天然硒多糖的紅外光譜及核磁共振譜圖進一步推斷出其的初步結構。體外活性試驗表明，該多糖對于DPPH自由基和ABTS自由基均具有明顯的清除作用，且隨濃度增加清除率逐漸升高；而其對H2O2誘導SH-SY5Y細胞損傷表現(xiàn)出顯著的保護作用。制備的天然硒多糖具有明顯的抗氧化活性和神經(jīng)細胞保護活性，為金櫻子天然硒多糖的研究提供理論依據(jù)，并為金櫻子在功能性食品及神經(jīng)細胞保護疾病藥物的開發(fā)奠定基礎。