艾葉多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)表征及抗氧化活性

陳同強(qiáng) ，李燦 ，郭錦材，徐文泱 ，何青科，李凱龍

1.湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院（長(zhǎng)沙 410007）；2.食品安全監(jiān)測(cè)與預(yù)警湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（長(zhǎng)沙 410111）；3.長(zhǎng)沙市口腔醫(yī)院（長(zhǎng)沙 410006）；4.湖南省植物保護(hù)研究所（長(zhǎng)沙 410125）

艾葉，為菊科植物艾（Artemisia argyiLevl.et Vant.）的干燥葉，廣泛分布于我國(guó)大部分地區(qū)。其藥用價(jià)值主要包括溫經(jīng)止血、散寒止痛；外用有祛濕、驅(qū)蚊、止癢等功效[3]。艾葉的嫩芽及幼苗可作蔬菜食用，在民間還有把采摘的艾葉和糯米一起制成“蒿子糍粑”的習(xí)俗。研究表明艾葉中除主要成分揮發(fā)油外，還含有黃酮、萜類、多糖等有機(jī)化合物成分[2-3]。

多糖由10個(gè)（含）以上的單糖通過(guò)糖苷鍵縮聚而成，主要分為植物多糖、動(dòng)物多糖及微生物多糖3類。大量的藥理以及臨床試驗(yàn)表明，多糖類化合物能夠激活人體免疫細(xì)胞，從而提高機(jī)體的免疫力，且對(duì)正常細(xì)胞幾乎無(wú)毒副作用[4]。

目前對(duì)艾葉多糖研究主要包括提取工藝、抗氧化作用、抗腫瘤作用以及免疫調(diào)節(jié)等[5-7]，而對(duì)艾葉多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)表征及純品組分抗氧化活性研究報(bào)道鮮見(jiàn)。試驗(yàn)通過(guò)對(duì)艾葉水提取乙醇沉淀得到粗多糖，再經(jīng)脫色、脫蛋白、柱色譜分離純化等過(guò)程處理后最終得到2種純多糖組分。通過(guò)對(duì)2種多糖化合物的糖含量、單糖組成、相對(duì)分子質(zhì)量、分子特征等指標(biāo)以及其體外抗氧化活性進(jìn)行研究分析，為進(jìn)一步研究艾葉中多糖的構(gòu)效關(guān)系以及艾葉的綜合開(kāi)發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

干燥艾葉（粉碎至約0.250 mm孔徑大小，備用）；單糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（L-鼠李糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、肌醇、D-半乳糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸）、肌醇（內(nèi)標(biāo)），中國(guó)藥品生物制品檢定所；陰離子交換纖維素DEAE-52（英國(guó)Whatman公司）；葡聚糖凝膠Sephadex G-200（百浩天生物科技有限公司）；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

透析袋（截留分子質(zhì)量3500 Da，上海易佰聚經(jīng)貿(mào)有限公司）；高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 600；紫外可見(jiàn)檢測(cè)器DAD，示差檢測(cè)器RI，UltrahydrogelTM1000、500色譜柱，7.8 mm×300 mm，美國(guó)Waters）；十八角度激光散射儀（MALLS）；氣相色譜儀GC-2010（日本島津），配OV-101石英毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm×0.33 μm）；BS-100N自動(dòng)部分收集器，恒流泵BT100N數(shù)顯恒流泵（上海青浦滬西儀器廠）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 多糖的提取

艾葉多糖的提取參照文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行。稱取1 kg干燥艾葉，搗碎，使用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇回流除去脂肪，殘?jiān)?0 ℃烘箱烘干后稱其質(zhì)量，用20倍量的水在80 ℃的條件下提取2 h，過(guò)濾，重復(fù)提取1次，合并濾液，濃縮至一定體積，離心，取上清液，在不斷攪拌下加入95%乙醇使得溶液中乙醇的最終體積分?jǐn)?shù)為70%（V/V），靜置過(guò)夜，離心，收集沉淀，冷凍干燥，得到粗多糖，命名為AY。

1.3.2 AY的分離純化

AY通過(guò)Savag法除蛋白和H2O2法脫色素[9]后，樣液濃縮至一定體積，再按1.3.1方式醇沉2次，將得到沉淀溶解于水中，用自來(lái)水流水透析48 h，冷凍干燥，備用。

準(zhǔn)確稱取經(jīng)上述處理后的AY（200 mg）置于醋酸鈉-醋酸（NaAc-HAc）緩沖鹽（pH 5.2）溶液中，溶脹過(guò)夜，過(guò)陰離子交換柱（DEAE-52，Cl-，2.5 cm×70 cm，填料纖維素陰離子交換劑DEAE-52依次經(jīng)0.2 mol/L NaOH、0.2 mol/L HCl處理1 h，蒸餾水洗至中性）。先用NaAc-HAc緩沖鹽（pH 5.2）平衡過(guò)夜，上樣，先后用含0，0.1和0.3 mol/L NaCl的NaAc-HAc緩沖鹽（pH 5.2）流動(dòng)相洗脫，流速均為5 mL/10 min，以苯酚-硫酸法（490 nm）[10]隔管示蹤，以奇數(shù)管號(hào)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制曲線，收集合并主峰部分，透析，冷凍干燥。

準(zhǔn)確稱取將上述洗脫所得多糖（100 mg），過(guò)凝膠Sephadex G-200柱（2.6 cm×90 cm），Sephadex G-200葡聚糖凝膠預(yù)先用0.02% NaN3水溶液浸泡48 h，蒸餾水平衡1 d，裝樣，蒸餾水洗脫，流速為0.5 mL/min，每管收集約5 mL，采用苯酚-硫酸法測(cè)A490示蹤，繪制曲線，收集主峰部分，冷凍干燥。

1.3.3 多糖的相對(duì)分子質(zhì)量與分子特征分析

試樣制備：準(zhǔn)確稱取純化多糖樣品，流動(dòng)相配制成5 mg/mL溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，用高效凝膠色譜-十八角度激光散射聯(lián)用技術(shù)（HPGPC-MALLS）分析。

色譜條件：色譜柱，UltrahydrogelTM1000、500色譜柱串接；流動(dòng)相，含0.02% NaN3的0.1 mol/L NaNO3溶液；流速0.8 mL/min；柱溫40 ℃；MALLS的光源氣體，氦氣、氖氣；波長(zhǎng)690 nm。流動(dòng)相的折光指數(shù)1.298；組分在溶液中的折光指數(shù)增量（dn/dc）測(cè)得值約0.128；校準(zhǔn)激光的儀器常數(shù)7.8059×10-6（V·cm）-1，校準(zhǔn)示差折光檢測(cè)器儀器常數(shù)2.1455×10-4（V·cm）-1。

1.3.4 單糖組成分析

標(biāo)準(zhǔn)品及樣品處理參考文獻(xiàn)[11]。

氣相色譜（GC）條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣模式，分流，分流比10∶1；進(jìn)樣體積1.0 μL；檢測(cè)器溫度280 ℃。程序升溫：160 ℃，保持4.0 min，以5℃/min升至190 ℃，保持4.0 min，然后以3 ℃/min升至最終溫度210 ℃，保持15.0 min，最后以10 ℃/min升至260 ℃，保持5 min。

1.3.5 抗氧化活性分析

將分離純化后的艾葉多糖組分配制成質(zhì)量濃度分別為0，0.1，0.2，0.5，0.8和1.0 mg/mL的多糖系列溶液，參照文獻(xiàn)[12-14]方法，測(cè)定艾葉多糖組分對(duì)DPPH自由基、羥自由基、ABTS自由基3類自由基的清除率，上述試驗(yàn)均采用維生素C（VC）作為陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果與討論

2.1 粗多糖（AY）的分離純化

AY脫蛋白色素處理后，經(jīng)DEAE-52 Cl-離子交換柱色譜分離，用含0.1 mol/L NaCl的NaAc-HAc緩沖鹽（pH 5.2）流動(dòng)相洗脫得到AY-1，AY-2和AY-3這3個(gè)組分多糖，如圖1所示，因AY-2和AY-3濃度較低，富集相對(duì)困難，選擇AY-1進(jìn)一步分離純化。將AY-1經(jīng)SephadexG-200凝膠柱色譜純化，得到兩個(gè)多糖組分，見(jiàn)圖2，分別集中收集，用自來(lái)水流水透析1 d，蒸餾水磁力攪拌透析1 d，濃縮，冷凍干燥，分別命名為AY-1A和AY-1B。

圖1 AY的陰離子交換纖維素柱色譜洗脫圖

圖2 AY-1的凝膠柱色譜洗脫圖

2.2 AY-1A與AY-1B兩個(gè)組分純度鑒定與理化分析

AY-1A與AY-1B兩個(gè)組分色譜出峰均呈現(xiàn)單一對(duì)稱峰，說(shuō)明兩個(gè)多糖組分純度較高，紫外光譜圖為典型的多糖吸收光譜，且在波長(zhǎng)280 nm與260 nm處吸收很弱，排除了AY-1A與AY-1B為糖蛋白（或蛋白糖）與核酸的可能性。經(jīng)苯酚硫酸測(cè)得AY-1A與AY-1B兩個(gè)組分中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為95.8%和97.3%。

2.3 AY-1A與AY-1B分子特征分析

表1顯示：AY-1A的重均分子質(zhì)量（MW）高于AY-1B，AY-1A的多分散系數(shù)MW/Mn=2.048，處于2～3之間，屬于中等分布寬度樣品；AY-1B多分散系數(shù)接近于1，屬于窄分布樣品，當(dāng)MW/Mn=1時(shí)，則認(rèn)為樣品的相對(duì)分子質(zhì)量分布是均一的。

表1 AY-1A與AY-1B的分子特征參數(shù)

AY-1A與AY-1B的Rg都較小，AY-1A的Rg要小于AY-1B的Rg，這與重均分子質(zhì)量大小順序剛好相反，分析原因是由AY-1A在該電解質(zhì)（鹽）溶液（0.1 mol/L NaNO3）中分子形狀發(fā)生皺縮而引起分子尺寸大小降低造成的。

對(duì)AY-1A與AY-1B的Rg與Mw分別繪制曲線，由Astra處理軟件計(jì)算得，AY-1A的斜率為0.32±0.02，如圖3所示，而AY-1B的線性關(guān)系較差，類似U型曲線，如圖4所示。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)斜率為1時(shí)，表示高分子在溶液中是棒狀排列；當(dāng)斜率為0.4～0.6時(shí)，則表示高分子在溶液中呈線性無(wú)規(guī)則線團(tuán)；當(dāng)斜率約為0.33時(shí)，則表示為球狀形態(tài)[15]。由此可知：AY-1A在流動(dòng)相溶液中呈球形構(gòu)象；AY-1B結(jié)構(gòu)則呈典型的高枝化度結(jié)構(gòu)，這是因?yàn)橄嗤肿淤|(zhì)量的支鏈化多糖與線形多糖相比較，枝化多糖分子的旋轉(zhuǎn)半徑要更大，從而引起曲線彎折，如U型。

圖3 AY-1A的均方根旋轉(zhuǎn)半徑（Rg）與重均分子質(zhì)量（MW）之間的關(guān)系

圖4 AY-1B的均方根旋轉(zhuǎn)半徑（Rg）與重均分子質(zhì)量（MW）之間的關(guān)系

2.4 單糖組成分析

通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)單糖保留時(shí)間的比較分析確定單糖組成，如圖5所示，并采用內(nèi)標(biāo)法定量計(jì)算組成單糖的摩爾比例。AY-1A是由葡萄糖組成的均多糖，如圖6所示；AY-1B則為由阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸組成的酸性雜多糖，如圖7所示。單糖組成的摩爾比例為c阿拉伯糖∶c半乳糖∶c半乳糖醛酸=50.27∶40.59∶9.14，其中阿拉伯糖與半乳糖含量較高。

圖5 混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品的GC圖

圖6 AY-1A的的單糖組成GC圖

圖7 AY-1B的單糖組成GC圖

2.5 抗氧化活性分析

圖8（A）顯示：艾葉多糖AY-1A與AY-1B對(duì)DPPH、羥自由基、ABTS自由基的清除能力具有一定的量效關(guān)系，隨著多糖濃度的升高而逐漸增強(qiáng)。DPPH清除率在AY-1A與AY-1B 0.0～0.4 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均明顯上升，當(dāng)AY-1A與AY-1B質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 時(shí)，兩者清除率達(dá)到最大值，分別為55.29%與65.97%，而陽(yáng)性對(duì)照品VC對(duì)DPPH自由基的清除率則高達(dá)98.50%。

圖8（B）顯示：當(dāng)AY-1A與AY-1B質(zhì)量濃度達(dá)到0.5 mg/mL后，增長(zhǎng)速率均趨于平緩，當(dāng)質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，AY-1A與 AY-1B對(duì)羥自由基清除率分別達(dá)到最大值（40.37%和53.23%）。

圖8（C）顯示：在質(zhì)量濃度 1.0 mg/mL的AY-1A與 AY-1B中，清除ABTS自由基的活性最大值分別為21.08%與37.91%。

圖8 AY-1A與AY-1B DPPH自由基（A）、羥自由基（B）、ABTS自由基（C）清除效果

綜上所述，AY-1A與 AY-1B均具有一定清除自由基能力，且AY-1B總體抗氧化活性強(qiáng)于AY-1A。這種差異性可能原因是AY-1B結(jié)構(gòu)中含有一定比例易電離基團(tuán)，如糖醛酸等。其抗氧化機(jī)理與多糖結(jié)構(gòu)的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)艾葉中多糖采用水提醇沉得到粗多糖，粗多糖經(jīng)除蛋白脫色素處理，先后經(jīng)陰離子DE-52交換柱色譜、Sephadex G-200葡聚糖凝膠色譜分離純化，最終得到AY-1A與AY-1B兩個(gè)多糖組分。結(jié)構(gòu)表征結(jié)果顯示AY-1A為由葡萄糖構(gòu)成的均多糖，AY-1B為由半乳糖、阿拉伯糖和半乳糖醛酸組成的酸性雜多糖。AY-1A在0.1 mol/L NaNO3溶液中呈球形構(gòu)象，AY-1B則呈高度支鏈化分子結(jié)構(gòu)；抗氧化活性試驗(yàn)證實(shí)，AY-1A與AY-1B均具備一定清除自由基能力，且AY-1B總體抗氧化性強(qiáng)于AY-1A，結(jié)果表明艾葉多糖具備被開(kāi)發(fā)成天然抗氧化劑的前景，同時(shí)為艾葉在醫(yī)學(xué)、化妝品以及食品工業(yè)等領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)與利用奠定了良好的基礎(chǔ)。