響應(yīng)面法優(yōu)化梅花鹿茸多肽口服液配方及穩(wěn)定性

姜瑋，暢柯飛，張鐵華

吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（長(zhǎng)春 130062）

鹿茸是傳統(tǒng)的名貴中藥材，俗有“東北三寶”之一的稱謂。據(jù)藥典記載，鹿茸具有壯腎陽(yáng)、益精血、強(qiáng)筋骨、調(diào)沖任、托瘡毒等功效。還有研究顯示，鹿茸具有增強(qiáng)免疫[1-2]、抗炎[3-5]、促進(jìn)傷口愈合[6]、抑菌[7]、改善腸道微生物菌群[8]等作用。

2014年，原國(guó)家食品藥品監(jiān)管總局發(fā)布通知，指出在符合國(guó)家主管部門野生動(dòng)物保護(hù)相關(guān)政策和規(guī)定情況下，允許養(yǎng)殖梅花鹿及其產(chǎn)品作為保健食品原料使用，拓寬養(yǎng)殖梅花鹿的使用范圍。吉林省是國(guó)內(nèi)最大的鹿養(yǎng)殖基地，其中梅花鹿占85%～90%，開發(fā)鹿茸保健食品對(duì)于促進(jìn)吉林省畜牧業(yè)發(fā)展、增加農(nóng)民收入、振興地方經(jīng)濟(jì)具有重要意義[9]。

市場(chǎng)化的鹿茸保健食品品種較少，多為片劑、粉劑、膠囊或者保健酒類，部分產(chǎn)品成分復(fù)雜，不利于特殊人群食用，如高血壓、高血糖人群等。此外，市場(chǎng)化的鹿茸口服液屬于藥品，不利于民眾接受和市場(chǎng)開拓。試驗(yàn)從保健食品的角度，在實(shí)驗(yàn)室酶解制備鹿茸多肽的基礎(chǔ)上，立足天然，明確劑量，研究開發(fā)食用型鹿茸多肽口服液，以達(dá)到豐富鹿茸產(chǎn)品類型、擴(kuò)大市場(chǎng)的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

冷凍鮮梅花鹿鹿茸。

檸檬酸、木糖醇（均為食品級(jí)）；堿性蛋白酶；乙酸、檸檬酸、氫氧化鈉、硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠、乙醇、苯酚、檸檬酸鈉、胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、瓊脂、磷酸二氫鉀、氯化鈉、硫酸鎂、氯霉素、四氯四碘熒光素（虎紅溶液）、丙酮酸鈉、甘氨酸、氯化鋰、磷酸氫二鈉、結(jié)晶紫、草酸銨、碘、碘化鉀等（均為分析純）。

中藥切片機(jī)；萬(wàn)能粉碎機(jī)；離心機(jī)；滅菌鍋；pH計(jì)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；海能全自動(dòng)凱氏定氮儀；氨基酸分析儀。

1.2 鹿茸多肽制備

將冷凍鮮梅花鹿茸清洗干凈，去皮毛，采用中藥切片機(jī)切成0.2～0.4 mm薄片，采用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，按料液比1∶150（g/mL）加入去離子水，加熱至90 ℃保持10 min，降溫至55 ℃，調(diào)pH 9.5～10，按5000 U/g加入堿性蛋白酶，酶解2 h，以12000 r/min離心，收集上清液，調(diào)pH 7，超濾，收集小于10 kDa的溶液，濃縮、凍干成粉末。

1.3 口服液配方設(shè)計(jì)

取一定量鹿茸多肽粉末，用去離子水按比例配制成溶液，加入不同量的檸檬酸、木糖醇調(diào)節(jié)口味。

1.3.1 感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

邀請(qǐng)40名經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的食品專業(yè)學(xué)生，男女各半，依據(jù)GB/T 12312—2012《感官分析 味覺(jué)敏感度的測(cè)定方法》對(duì)鹿茸口服液進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，從色澤狀態(tài)、滋味、香味、澄清度4個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分，具體評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.2 配方設(shè)計(jì)

根據(jù)《中國(guó)藥典》（2015版）推薦食用量1～2 g/d，試驗(yàn)中的梅花鹿茸中蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為53%，則1 g干鹿茸生藥含530 mg蛋白質(zhì)，即每天可攝入鹿茸蛋白530～1060 mg。按GB/T 10789—2015《飲料通則》的規(guī)定，蛋白飲料蛋白含量應(yīng)≥0.5%，故按GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，選用檸檬酸、木糖醇為調(diào)味劑，使用標(biāo)準(zhǔn)為按生產(chǎn)需要使用。

用0.15 mol/L乙酸、1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH，加入檸檬酸和木糖醇調(diào)節(jié)口味。每組試驗(yàn)配制100 mL，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行配方篩選，通過(guò)感官評(píng)價(jià)，確定配方。

1.4 穩(wěn)定劑篩選

選取評(píng)分最好的配方配制口服液，按照《中國(guó)藥典》（2015版）中化學(xué)藥物（原料藥和制劑）穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則的規(guī)定進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)。以離心沉淀率和穩(wěn)定性系數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察鹿茸口服液的穩(wěn)定性。

1.4.1 離心沉淀率

將配制好的口服液混勻后，按一定比例加入不同濃度的穩(wěn)定劑混勻，準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量樣品，于4000 r/min離心處理15 min，倒掉上清液后，稱定沉淀的質(zhì)量，每個(gè)樣品重復(fù)3次，計(jì)算離心沉淀率。一般情況下，離心沉淀率越低，產(chǎn)品越穩(wěn)定。

式中：m1為沉淀物質(zhì)量；m2為離心樣品質(zhì)量。

1.4.2 穩(wěn)定性系數(shù)

將配制好的口服液混勻后，準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量樣品，于4000 r/min離心處理15 min，吸取上清液，用去離子水稀釋（1∶20，φ），以水為空白對(duì)照，測(cè)定在200～400 nm處最大吸收峰的吸光度，離心前后吸光度的比值即為穩(wěn)定性系數(shù)，每個(gè)樣品重復(fù)3次，計(jì)算穩(wěn)定性系數(shù)。

式中：A1為離心后溶液最大吸收峰的吸光光度；A2為離心前溶液最大吸收峰的吸光度。

1.5 口服液理化指標(biāo)測(cè)定

口服液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》測(cè)定；可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)按GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》規(guī)定方法測(cè)定；鉛按GB 5009.12—2017《食品中鉛的測(cè)定》規(guī)定方法測(cè)定；砷按GB 5009.11—2014《食品中總砷及無(wú)機(jī)砷的測(cè)定》規(guī)定方法測(cè)定；氨基酸組成按GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測(cè)定》測(cè)定。

1.6 口服液微生物指標(biāo)測(cè)定

依據(jù)GB/T 23784—2009《食品微生物指標(biāo)制定和應(yīng)用的原則》和GB 16740—2014《保健食品》規(guī)定，對(duì)口服液中的菌落總數(shù)、霉菌、酵母菌、致病菌進(jìn)行檢測(cè)，具體參照GB 4789.2—2016《食品食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》、GB 4789.15—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》、GB 4789.3—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》GB 4789.4—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》和GB 4789.10—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》。

1.7 口服液穩(wěn)定性試驗(yàn)

將配制好的口服液裝瓶，于115 ℃滅菌30 min后，置于室溫保存6個(gè)月，分別于0，1，3和6個(gè)月取樣測(cè)定，測(cè)定多肽含量、菌落總數(shù)、pH及觀察口服液狀態(tài)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用軟件Design Expert 10和SPSS Statistics 20進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 口服液配方試驗(yàn)結(jié)果

感官評(píng)定是主觀判斷口服液的可接受度，感官評(píng)分越高，說(shuō)明口味越好，接受度越高。口服液的配方設(shè)計(jì)和感官評(píng)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及因素水平表

以感官評(píng)定評(píng)分為響應(yīng)值，利用Design Expert 10程序?qū)Ω泄僭u(píng)定結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得出編碼回歸方程Y=76-7.63X1+3.5X2+0.12X3+2.75X1X2+4.5X1X3+0.75X2X3+7.75X12-4.5X22+0.75X32。

得出實(shí)際因素的回歸方程Y=132-106.25X1+2.9X2-267.5X3+1.1X1X2+180X1X3+3X2X3+31.5X12-0.18X22+300X32。

在α=0.05顯著水平下對(duì)所得回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)與方差分析，分析結(jié)果見(jiàn)表3。回歸方程模型F=147.55，p＜0.0001，回歸模型是極顯著的；模型R2=0.9962＞0.95，Radj2=0.9895＞0.95，說(shuō)明試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值擬合度高；失擬項(xiàng)p=0.6812＞0.05，說(shuō)明模型失擬值是極不顯著的，因此模型可以用于感官評(píng)定的預(yù)測(cè)。由于多肽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低值至少為0.5%，故在指定范圍內(nèi)，模型預(yù)測(cè)最優(yōu)結(jié)果為多肽0.5%、木糖醇9.8%、檸檬酸0.03%，感官評(píng)分預(yù)測(cè)值為98.97分，試驗(yàn)值與之相符，口感相比較好。

表3 模型方差分析

通過(guò)軟件Design Expert 10分析得到檸檬酸、鹿茸多肽、木糖醇3個(gè)因素兩兩交互作用，見(jiàn)圖1。鹿茸多肽含量和木糖醇含量變化對(duì)感官評(píng)價(jià)影響較大，多肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%時(shí)，檸檬酸和木糖醇通過(guò)一定比例調(diào)配，感官評(píng)價(jià)顯示可以接受。但固定木糖醇、檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)，鹿茸多肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化對(duì)口服液感官評(píng)分影響明顯，這可能是鹿茸多肽具有明顯的特殊氣味，是導(dǎo)致鹿茸多肽口服液影響感官評(píng)定的主要因素。

圖1 鹿茸多肽、木糖醇、檸檬酸兩兩交互作用的曲面圖

2.2 口服液穩(wěn)定劑篩選結(jié)果

為避免調(diào)配好口味的口服液放置有微小沉淀的現(xiàn)象，進(jìn)一步考察穩(wěn)定劑對(duì)口服液穩(wěn)定性的影響。采用L9(34)進(jìn)行優(yōu)選，試驗(yàn)值Yi與預(yù)測(cè)值Yi’見(jiàn)表4，通過(guò)極差分析，影響因素大小順序?yàn)镃＞A＞B，即CMC-Na（C）＞三聚磷酸鈉（A）＞果膠（B）。綜合正交表確定的最適合組合為A3B3C2，即CMC-Na 0.04%、三聚磷酸鈉0.06%、果膠0.06%，口服液的離心沉淀率最低為3.19%。

表4 正交L9(34)篩選復(fù)合穩(wěn)定劑的離心沉淀率

以穩(wěn)定性系數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，試驗(yàn)值Yi與預(yù)測(cè)值Yi’見(jiàn)表5。通過(guò)極差分析，影響因素大小順序?yàn)槿哿姿徕c（A）＞果膠（B）＞CMC-Na（C），綜合正交表確定的最適合組合為A3B3C2，即三聚磷酸鈉0.06%、果膠0.06%、CMC-Na 0.04%，穩(wěn)定系數(shù)為87.54%，與口服液的沉淀率研究結(jié)果一致。

表5 正交L9(34)篩選復(fù)合穩(wěn)定劑的穩(wěn)定性系數(shù)

2.3 口服液理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

鹿茸多肽口服液的理化測(cè)定結(jié)果顯示（表6），可溶性固形物、鉛、砷均滿足相關(guān)要求，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.50%～0.52%。

表6 理化指標(biāo)

對(duì)口服液的氨基酸組成進(jìn)行分析，具體結(jié)果如表7所示。必需氨基酸的總量占比20.45%；非必需氨基酸中甘氨酸含量最高，其次為谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸和天冬氨酸，與王艷梅[10]、魏越[11]研究結(jié)果趨勢(shì)一致。

表7 口服液中16種氨基酸質(zhì)量濃度

2.4 口服液微生物指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

按照相關(guān)規(guī)定，在配制的幾個(gè)批次樣品中，致病菌、霉菌、酵母菌在所有樣液中均未檢出，少數(shù)幾個(gè)樣品檢出大腸桿菌，研發(fā)的鹿茸多肽口服液的微生物指標(biāo)符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求，見(jiàn)表8。

表8 微生物指標(biāo)

2.5 口服液貯藏試驗(yàn)結(jié)果

將口服液室溫放置、避光條件下貯存6個(gè)月后，貯藏試驗(yàn)結(jié)果具體見(jiàn)表9。微生物指標(biāo)測(cè)定符合GB 16740—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)保健食品》的要求，產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)成分變化較小并且感官性狀無(wú)明顯變化，略有少量沉淀，不影響產(chǎn)品質(zhì)量，在產(chǎn)品可接受范圍內(nèi)。

表9 貯藏試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

結(jié)果表明，鹿茸多肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、木糖醇9.8%、檸檬酸0.03%，口服液口味較好。穩(wěn)定劑CMC-Na 0.04%、三聚磷酸鈉0.06%、果膠0.06%時(shí)，離心沉淀率最低為3.19%，穩(wěn)定系數(shù)為87.54%，即口服液的穩(wěn)定狀態(tài)最好?？诜旱睦砘笜?biāo)和微生物指標(biāo)都符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求。養(yǎng)鹿業(yè)是吉林省重要的特色優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)之一，在振興東北老工業(yè)基地的大環(huán)境下，提高養(yǎng)殖梅花鹿的精深加工產(chǎn)品的生產(chǎn)規(guī)模和附加值，運(yùn)用生物工程技術(shù)，提升產(chǎn)品品質(zhì)，打造地域特色鮮明的產(chǎn)品，具有實(shí)際意義。