桑葉蛋白飲料的研制

祁芳，杜昕, ，張麗，秦瑞博，劉松青,

1.成都師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院（成都 611130）；2.成都師范學(xué)院食品發(fā)酵研究所（成都 611130）；3.特色園藝生物資源開(kāi)發(fā)與利用四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（成都 611130）

植物葉蛋白是世界上最大的可再生蛋白質(zhì)資源之一，桑葉蛋白約占干基質(zhì)量的25%[1]，且中國(guó)桑樹分布廣泛，桑葉資源豐富。桑葉中含有多種營(yíng)養(yǎng)成分并具有一定藥用價(jià)值[2]，如：維生素B1、維生素B2及維生素C[3]有利于維持神經(jīng)、心臟及消化系統(tǒng)的正常機(jī)能；黃酮、多酚等具有較強(qiáng)的抗氧化作用[4]。除此之外，桑葉中的多糖和生物堿可以調(diào)節(jié)血壓、血糖和降血脂等[5-6]。近年來(lái)，桑葉資源的研究逐漸活躍，產(chǎn)品開(kāi)發(fā)成為熱點(diǎn)，桑葉被作為功能性食品原料生產(chǎn)桑葉面條、豆腐、調(diào)味醬等多種產(chǎn)品[7-9]。馬慧等[10]以鮮桑葉與桑葚為原料制作桑葚葉果汁飲料；谷薇薇等[11]以桑葉、葛根、苦瓜籽等為原料制備復(fù)合固體飲料；李盡哲等[12]以桑葉和蛹蟲研制出一款風(fēng)味獨(dú)特、保健功能穩(wěn)定的飲品，黃酮質(zhì)量濃度達(dá)8.0 mg/mL；陳小敏等[13]研制的桑葉配方飲料能有效改善糖尿病小鼠多飲多食癥，抑制體質(zhì)量下降，具有輔助降糖效果。在2018年的“全球創(chuàng)新食品領(lǐng)域投資交易項(xiàng)目”中，植物蛋白飲料交易額市場(chǎng)增長(zhǎng)率達(dá)17%[14]，消費(fèi)潛力巨大。

桑葉作為一種高蛋白食用資源，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值不可估量[15]。熊瑤[16]采用復(fù)合蛋白酶法提取辣木葉蛋白并制作辣木葉蛋白飲料，得出浸提液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.17%，飲品蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥0.1%。王芳等[17]以0.4%的NaCl溶液為提取溶劑，料液比1∶30，超聲波400 W，超聲處理20 min，40 ℃水浴浸提桑葉60 min，葉蛋白得率為9.93%。楊晶等[18]研究NaOH、NaCl和水為浸提劑對(duì)桑葉蛋白提取的影響，得出以NaOH為浸提劑提取蛋白效果最佳。試驗(yàn)采用超聲輔助水浴浸提桑葉蛋白，并以浸提液為原料制作蛋白飲品，為葉蛋白的提取和精深加工奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)原料

新鮮桑葉（品種為湖桑、荷葉白一號(hào)、大葉野生子、九龍拐；成都師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院試驗(yàn)田）。

白砂糖、檸檬酸、蜂蜜（市售，成都市溫江區(qū)大潤(rùn)發(fā)超市）。

1.2 試驗(yàn)試劑

考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清蛋白、95%乙醇、85%磷酸、次甲基藍(lán)、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、硫酸銅、氫氧化鈉、冰醋酸等（均為分析純）；葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3 試驗(yàn)儀器

FA1004分析天平（常州幸運(yùn)科技有限公司）；721可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）；DHG-9140恒溫干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；HWS12恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；pH-10型筆式pH計(jì)（上海力辰邦西儀器科技有限公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 工藝流程

鮮桑葉→清洗、干燥、粉碎→超聲輔助水浴提取→過(guò)濾→調(diào)配→均質(zhì)→殺菌、脫氣→產(chǎn)品

1.4.2 操作要點(diǎn)

1.4.2.1 原料處理

選用無(wú)病蟲害、無(wú)霉斑、無(wú)腐爛、外觀完整的優(yōu)質(zhì)新鮮桑葉，浸泡清洗，淋洗1次。用恒溫干燥箱將清洗好的桑葉進(jìn)行干燥，除去水分后用超速粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，便于桑葉中的有效成分提取。

1.4.2.2 超聲輔助水浴浸提桑葉蛋白單因素試驗(yàn)

超聲輔助水浴浸提桑葉蛋白試驗(yàn)基本參數(shù)設(shè)置：固液比1∶30（g/mL），在40 ℃下分別超聲30 min，于50 ℃水浴浸提1 h，以浸提液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為檢測(cè)指標(biāo)，分別考察超聲時(shí)間（20，30，40，50和60 min）、超聲溫度（30，40，50，60和70 ℃）、固液比（1∶30，1∶40，1∶50，1∶60和1∶70 g/mL）、水浴溫度（20，30，40，50和60 ℃）和水浴時(shí)間（20，40，60，80和100 min）這5個(gè)因素對(duì)桑葉浸提液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，每組進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。

1.4.2.3 超聲輔助水浴浸提桑葉蛋白響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取影響較大的3個(gè)因素進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面設(shè)計(jì)，確定最佳工藝條件。

1.4.2.4 過(guò)濾

將浸提后的浸提液采用4層過(guò)濾紗布進(jìn)行過(guò)濾，除去不溶性雜質(zhì)。

1.4.2.5 飲品配方研制試驗(yàn)

以感官評(píng)分為指標(biāo)，分別考察桑葉浸提液添加量（30%，35%，40%，45%和50%）、檸檬酸添加量（0.10%，0.15%，0.20%，0.25%和0.30%）、白砂糖添加量（1%，2%，3%，4%和5%）和蜂蜜添加量（7%，8%，9%，10%和11%）對(duì)飲品質(zhì)量的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取影響較大的3個(gè)因素進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面設(shè)計(jì)，確定最佳產(chǎn)品配方。

1.4.2.6 均質(zhì)

將調(diào)配好的桑葉飲料用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)，獲得穩(wěn)定的、液相均勻的飲品。

1.4.2.7 殺菌、脫氣

采用加熱的方式對(duì)飲品進(jìn)行殺菌、脫氣處理。

1.4.2.8 灌裝

采用安全滌綸樹脂（PET）材質(zhì)的塑料瓶進(jìn)行灌裝，留整個(gè)容積6%的頂隙，得到產(chǎn)品。

1.4.3 指標(biāo)測(cè)定

1.4.3.1 感官指標(biāo)（見(jiàn)表1）

表1 感官評(píng)價(jià)表

1.4.3.2 理化指標(biāo)

蛋白質(zhì)，參照考馬斯亮藍(lán)法[19]測(cè)定蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，樣品稀釋倍數(shù)5倍；還原糖，參照GB 5009.7—2016《食品中還原糖的測(cè)定》（直接滴定法）進(jìn)行測(cè)定；pH，參考柑橘可溶性固形物和總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定方法比較[20]，采用手持式pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定；可溶性固形物，參考柑橘可溶性固形物和總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定方法比較[20]，采用手持式折光儀進(jìn)行測(cè)定。

1.4.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用Microsoft Excel 2010、Design Expert.V8.0.6.1、SPSS 24軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助水浴浸提桑葉蛋白單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲時(shí)間對(duì)桑葉浸提液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

從圖1可看出：隨著時(shí)間延長(zhǎng)，浸提液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增加，超聲50 min，浸提液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，隨后降低。超聲使細(xì)胞破碎便于蛋白質(zhì)溶出，超聲達(dá)到50 min后水溶性蛋白大部分溶出，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間反而使其他可溶性物質(zhì)溶出，影響蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定。由于超聲40和50 min對(duì)桑葉浸提液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響差異不顯著（p＞0.05），而超聲40 min可節(jié)省工藝時(shí)間，所以選擇超聲40 min為宜。

圖1 超聲時(shí)間對(duì)桑葉浸提液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.1.2 超聲溫度對(duì)桑葉浸提液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

從圖2可看出：超聲溫度40 ℃時(shí)，浸提液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，隨后降低，而溫度70 ℃時(shí)又上升（p＜0.05）。造成這種現(xiàn)象可能原因是溫度過(guò)高，特別是超聲溫度超過(guò)50 ℃，熱效應(yīng)使蛋白質(zhì)開(kāi)始變性聚集，從而影響桑葉蛋白質(zhì)的提取，而在70 ℃時(shí)升高可能是此時(shí)高溫超聲具有去聚集作用，干擾蛋白質(zhì)之間共價(jià)和非共價(jià)交聯(lián)。由于長(zhǎng)時(shí)間高溫對(duì)儀器損害大，且高溫超聲將破壞浸提液中一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所得蛋白質(zhì)也失去活性，因此選擇超聲溫度30～50 ℃較為合適。

圖2 超聲溫度對(duì)桑葉浸提液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.1.3 固液比對(duì)桑葉浸提液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

從圖3可看出：固液比1∶30～1∶60（g/mL）之間蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，1∶60（g/mL）之后趨于平緩（p＞0.05）。這可能是由于固液比低時(shí)，浸提液黏度大導(dǎo)致蛋白溶出困難。料液比過(guò)高時(shí)，稀釋度太高，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)則會(huì)相應(yīng)較低。由于后續(xù)試驗(yàn)需要用浸提液制作飲品，為節(jié)約成本又保證提取液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，采用固液比1∶50（g/mL）為最佳。

圖3 固液比對(duì)桑葉浸提液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.1.4 水浴溫度對(duì)桑葉浸提液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

如圖4所示：隨著水浴溫度提高，浸提液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)也逐漸提高，水浴溫度60 ℃時(shí)達(dá)到最高（p＜0.01）。這可能是因?yàn)闇囟鹊蜁r(shí)，分子熱運(yùn)動(dòng)不夠劇烈，從而蛋白質(zhì)分子溶解不出來(lái)，隨著溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)加劇，更多蛋白質(zhì)溶解出來(lái)。水浴溫度高于60 ℃，高溫使蛋白質(zhì)變性，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。因此，選取50～70 ℃為最佳水浴溫度范圍。

圖4 水浴溫度對(duì)桑葉浸提液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.1.5 水浴時(shí)間對(duì)桑葉浸提液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由圖5可知：在水浴60 min之前，浸提液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增高，在60～80 min急劇下降（p＜0.05）。這可能是因?yàn)殡S著時(shí)間延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)開(kāi)始凝聚，出現(xiàn)沉淀，在過(guò)濾時(shí)隨著殘?jiān)黄鸨贿^(guò)濾掉，從而降低浸提液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。因此，探究水浴時(shí)間40～80 min對(duì)桑葉浸提液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響。

圖5 水浴時(shí)間對(duì)桑葉浸提液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.2 超聲輔助水浴浸提桑葉蛋白響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面模型建立

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇超聲溫度、水浴溫度、水浴時(shí)間3個(gè)變量設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面，超聲輔助水浴浸提的響應(yīng)面因素水平見(jiàn)表2，試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 超聲輔助水浴浸提的響應(yīng)面因素水平表

對(duì)表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到二次多元回歸模型：Y=1.90+0.16A+0.097B+0.44C-0.21AB+0.067AC-0.10BC-0.67A2-0.41B2+0.033C2。

表3 超聲輔助水浴浸提響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.2 模型顯著性檢驗(yàn)

模型的方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。該回歸模型的p值小于0.05，模型顯著。失擬項(xiàng)p值（0.1362）大于0.05，失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著，該模型的模擬精確。由模型總決定系數(shù)R2為0.9821可知，預(yù)測(cè)值和真實(shí)值之間具有高度相關(guān)性，因此可用該模型分析預(yù)測(cè)超聲輔助水浴浸提桑葉蛋白的結(jié)果。一次項(xiàng)C極顯著，A、B顯著，二次項(xiàng)A2極顯著，B2顯著，C2不顯著，交互項(xiàng)除AB顯著外，其余交互效應(yīng)均不顯著。根據(jù)F值判斷A、B、C這3個(gè)因素對(duì)桑葉浸提液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響大小順序是C＞A＞B。

表4 回歸模型顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 響應(yīng)曲面分析

由圖6可知：超聲溫度40 ℃、水浴溫度60 ℃時(shí)響應(yīng)值達(dá)到最大值，超聲溫度與水浴溫度響應(yīng)曲面陡峭且等高線呈橢圓形，交互作用顯著。超聲溫度一定時(shí)，隨著水浴溫度升高，提取液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)先增加后減小，水浴溫度一定時(shí)，隨著超聲溫度增加提取液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)。其余交互作用不顯著。

圖6 超聲溫度與水浴溫度交互影響桑葉蛋白提取的曲面圖及等高線圖

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照模型所得最佳提取工藝參數(shù)，選擇超聲時(shí)間40 min、超聲溫度42 ℃、固液比1∶50（g/mL）、水浴溫度60 ℃、水浴時(shí)間80 min進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，所得浸提液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.189%，與理論預(yù)測(cè)值相接近。因此，模型預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.3 飲品配方研制試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 飲品研制響應(yīng)面模型建立

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇桑葉浸提液添加量、蜂蜜添加量、檸檬酸添加量3個(gè)因素設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面，因素水平表見(jiàn)表5，響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 飲品研制響應(yīng)面因素水平表 單位：%

對(duì)表6的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到二元回歸模型：Y=86.22-4.60A+0.41B+0.11C+1.65AB-0.45AC+4.83BC-1.22A2-3.50B2-6.05C2。

表6 飲品研制的響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3.2 回歸模型顯著性檢驗(yàn)

該模型顯著性檢驗(yàn)結(jié)果如表7所示。該模型p值（p=0.0086）小于0.05，模型顯著，即回歸模型與實(shí)際測(cè)量值擬合程度很高。失擬項(xiàng)p值（0.0785）大于0.05，失擬項(xiàng)不顯著。該模型總決定系數(shù)R2為0.9012，說(shuō)明預(yù)測(cè)值和真實(shí)值之間具有高度相關(guān)性，可用該模型分析預(yù)測(cè)飲品研制的結(jié)果。顯著性影響因素包括A、BC、B2、C2，其余項(xiàng)均不顯著。根據(jù)F值的大小可判斷試驗(yàn)因素對(duì)飲品品質(zhì)的影響，F(xiàn)值越大，則影響越大，因此可知A、B、C這3個(gè)因素對(duì)飲品質(zhì)量影響的大小順序依次是A＞B＞C。

表7 回歸模型顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

2.3.3 響應(yīng)曲面分析

由圖7可知：蜂蜜添加量與檸檬酸添加量的響應(yīng)曲面陡峭，所以兩者之間交互作用顯著，等高線呈現(xiàn)橢圓形明顯。蜂蜜添加量9%、檸檬酸添加量0.2%時(shí)，響應(yīng)值達(dá)到最高值。在蜂蜜添加量8.5%～9.5%、檸檬酸添加量0.18%～0.23%范圍內(nèi)，感官評(píng)分響應(yīng)值可達(dá)到最佳區(qū)域。檸檬酸添加量超過(guò)0.2%時(shí)，感官評(píng)分呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。

圖7 蜂蜜添加量與檸檬酸添加量交互影響飲品質(zhì)量的曲面圖及等高線圖

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)模型所得飲品最佳配方，按桑葉浸提液添加量35%、蜂蜜添加量8.8%、白砂糖添加量3%、檸檬酸添加量0.20%進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，平行3次。試驗(yàn)得出飲品感官評(píng)分為86.9分，結(jié)果與預(yù)測(cè)相符合。

2.4 理化指標(biāo)的結(jié)果分析

理化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果如表8所示，各指標(biāo)均符合普通飲品要求。

表8 各指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇合適的濃度范圍，采用Box-Behnken響應(yīng)面分析法對(duì)桑葉蛋白提取及飲品研制進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，桑葉以固液比1∶50（g/mL），在42 ℃下超聲40 min，在60 ℃溫度下水浴80 min，得到浸提液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，可達(dá)2.189%；以桑葉浸提液制作飲品，添加35%浸提液、0.20%檸檬酸、3%白砂糖、8.8%蜂蜜，此配方下得出的飲品呈鮮亮黃綠色，色澤均勻，桑葉香氣濃郁，回味甘甜，滿足人們的嗜好。通過(guò)理化指標(biāo)檢測(cè)，飲品pH 2.8，在正常飲料pH范圍內(nèi)，還原糖為16.2%，可溶性固形物為10%，蛋白質(zhì)為0.859%，均達(dá)到普通飲品的質(zhì)量要求。試驗(yàn)達(dá)到提高桑葉提取液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的預(yù)期要求，研制出桑葉飲品最佳配方，對(duì)蛋白提取工藝的研究具有一定意義，為桑葉副產(chǎn)品深加工提供參考。