黃花酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化

張江寧，楊春，南曉潔，郭尚

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西功能食品研究院（太原 030031）

黃花菜被列為“四大素山珍”之一，色澤金黃，香味濃郁，味道鮮美，營養(yǎng)價值高，富含糖類、蛋白質(zhì)、維生素、無機鹽及多種人體必需的氨基酸，具有平肝養(yǎng)血、消腫利尿、抗菌消炎、止血、鎮(zhèn)痛、通乳、健胃和安神的功能。研究發(fā)現(xiàn)鮮黃花菜經(jīng)冷凍干燥，其總黃酮、總氨基酸、總糖含量明顯高于自然干制黃花菜，冷凍干燥工藝能最大限度地保留黃花菜營養(yǎng)成分，并且實現(xiàn)及時加工。但是目前對于冷凍干燥黃花菜相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)較少。此次試驗以冷凍干燥黃花菜為發(fā)酵主原料，在發(fā)酵液中適當添加碳源，選用經(jīng)馴化的乳酸菌作為發(fā)酵菌種，對乳酸菌發(fā)酵黃花菜的工藝進行優(yōu)化，為黃花菜的利用提供一種新的思路，這不僅能夠最大化利用黃花菜這種優(yōu)質(zhì)資源，還能促進黃花菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍干燥黃花菜，大同冰華食品有限公司；干酪乳桿菌（Lactobacillus casei），菌種由實驗室提供。氫氧化鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、濃鹽酸、福林酚、沒食子酸、甲基紅、葡萄糖、次甲基藍、亞鐵氰化鉀，市售。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；721型分光光度計（上海光學(xué)儀器廠）；發(fā)酵罐（賽多利斯集團）；恒溫培養(yǎng)箱（上海森信實驗儀器有限公司）；電熱鼓風(fēng)恒溫干燥器（上海森信實驗儀器有限公司）；水浴鍋（金壇市億能實驗儀器廠）；離心機（上海繼譜電子科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵黃花菜酵素的制備流程

1.3.2 操作要點

將冷凍干燥黃花菜粉碎，按照一定料液比加入水，煮沸并保持3 min。冷卻至40 ℃后，接種菌種，于室溫條件避光發(fā)酵一定時間后，置于離心管中，在8000 r/min條件下離心10 min，棄沉淀物，將得到的上清液置于-20 ℃保存，待測。

1.3.3 測定指標與測定方法

1.3.3.1 總糖測定

總糖參照GB/T 10782—2006《食品中總糖的測定》的方法測定。

1.3.3.2 總酸測定

總酸參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》的方法測定，測定結(jié)果以乳酸質(zhì)量濃度（g/100 mL）計。

1.3.3.3 總酚測定

參照蔣增良等[1]的方法，采用福林酚法檢測總酚。

1.3.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.0.6.1軟件及SPSS 24.0軟件進行數(shù)據(jù)處理及分析。

1.3.4 單因素試驗

以黃花菜酵素總糖、總酸、總多酚質(zhì)量分數(shù)為評價指標，考察糖添加量、菌種接種量、料液比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間5個因素對產(chǎn)品品質(zhì)的影響，并確定各因素的最佳值。單因素試驗采用的固定參數(shù)為冷凍干燥黃花菜20 g、料液比6%、蔗糖添加量3%、接種量0.5%、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間6 d。固定其他因素，變化一個因素進行優(yōu)化，因素變化范圍為料液比（2%～8%）、蔗糖添加量（1%～7%）、接種量（0.1%～0.7%）、發(fā)酵溫度（31～40 ℃）、發(fā)酵時間（0～8 d）。

1.3.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

參數(shù)運用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計進行優(yōu)化，以影響產(chǎn)品質(zhì)量主要參數(shù)作為輸入變量，評估產(chǎn)品質(zhì)量指標作為輸出變量。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，將接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間作為試驗因素。為更全面地考察因素對結(jié)果的影響，將總酸、總多酚作為響應(yīng)值，進行三因素三水平共17個試驗點的響應(yīng)面分析試驗，優(yōu)化生產(chǎn)工藝，每個組合重復(fù)試驗3次，試驗因素水平編碼見表2。

表1 試驗因素水平編碼表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 糖添加量對黃花菜酵素總糖、總酸、總多酚的影響

以糖類物質(zhì)作為微生物發(fā)酵過程中的主要碳源，通過總糖質(zhì)量分數(shù)變化分析微生物生長和代謝狀況[2]。總酸也是衡量發(fā)酵成熟度的主要指標，同時也是反映其質(zhì)量品質(zhì)的重要理化指標[3]，糖添加量對黃花菜發(fā)酵總糖、總酸、總多酚影響的結(jié)果如圖1和圖2所示。當糖添加量小于3%時，總糖質(zhì)量分數(shù)不斷降低，總酸質(zhì)量分數(shù)升高，多酚質(zhì)量濃度增加。當糖添加量大于3%時，總糖質(zhì)量分數(shù)不斷增加，總酸質(zhì)量分數(shù)雖有波動但區(qū)別不大，多酚質(zhì)量濃度降低?？偺?、總酸質(zhì)量分數(shù)代表發(fā)酵進行的程度，總糖質(zhì)量分數(shù)越低，總酸質(zhì)量分數(shù)越高，發(fā)酵越徹底，同時原料利用率越高。綜合考慮，最終糖添加量選用3%。

圖1 糖添加量對總糖、總酸質(zhì)量分數(shù)的影響

圖2 糖添加量對總多酚質(zhì)量濃度的影響

2.1.2 菌種接種量對黃花菜酵素總糖、總酸、總多酚的影響

由圖3可知：隨著接種量增加，總酸質(zhì)量分數(shù)不斷升高，總糖質(zhì)量分數(shù)不斷降低，說明菌種的加入有效促進發(fā)酵反應(yīng)。當接種量小于0.3%時，總糖質(zhì)量分數(shù)下降不明顯。當接種量大于0.3%時，總糖質(zhì)量分數(shù)明顯下降，這說明接種量太低導(dǎo)致菌體在發(fā)酵過程中生長較慢，故代謝少，而大的接種量有利于縮短菌體生長的調(diào)整期，加速總糖降解。由圖4可知：當接種量為0.5%時，總多酚質(zhì)量濃度最高，這是由于乳酸菌產(chǎn)生的酶類及有機酸使黃花菜中酚類物質(zhì)溶出并呈游離態(tài)，導(dǎo)致發(fā)酵過程中總酚質(zhì)量濃度上升；當接種量為0.7%時，總多酚質(zhì)量濃度又有所下降，這可能是由優(yōu)勢菌種為維持自身生長產(chǎn)生降解酚類的物質(zhì)造成的。為使總糖較低、多酚較高，接種量選擇0.5%。

圖3 接種量對總糖、總酸質(zhì)量分數(shù)的影響

圖4 接種量對總多酚質(zhì)量濃度的影響

2.1.3 料液比對黃花菜酵素總糖、總酸、總多酚的影響

由圖5可知：隨著料液比增加，總糖質(zhì)量分數(shù)逐漸增大，之后趨于穩(wěn)定，總酸質(zhì)量分數(shù)逐漸增大，說明發(fā)酵過程中的發(fā)酵速度與發(fā)酵用原料濃度密切相關(guān)。料液比過低，物料中有效溶出物過低，因此總糖、總酸處于較低水平，隨著料液比增加，溶出物增加，發(fā)酵產(chǎn)物增多，發(fā)酵徹底。由圖6可知：當料液比為6%時，總多酚質(zhì)量濃度趨于穩(wěn)定；物料繼續(xù)增多，總多酚質(zhì)量濃度并未明顯增加，這是由于物料濃度過高不利于菌種的生長以及總多酚溶出。綜合考慮，料液比選擇6%。

圖5 料液比對總糖、總酸質(zhì)量分數(shù)的影響

圖6 料液比對總多酚質(zhì)量濃度的影響

2.1.4 發(fā)酵溫度對黃花菜酵素總糖、總酸、總多酚質(zhì)量分數(shù)的影響

由圖7可知：當溫度低于37 ℃時，隨著發(fā)酵溫度升高，總糖質(zhì)量分數(shù)逐漸降低，之后趨于穩(wěn)定，總酸質(zhì)量分數(shù)逐漸增大，說明發(fā)酵溫度過低直接影響菌絲生長、影響總糖的降解與總酸生成；當發(fā)酵溫度為37℃時，總糖質(zhì)量分數(shù)最低，總酸質(zhì)量分數(shù)最大，說明發(fā)酵徹底，原料利用率高。由圖8可知：溫度變化對總多酚質(zhì)量濃度的影響不大，說明該溫度變化范圍不足以對多酚的累計構(gòu)成影響。綜合考慮，發(fā)酵溫度選擇37 ℃。

圖7 發(fā)酵溫度對總糖、總酸質(zhì)量分數(shù)的影響

圖8 發(fā)酵溫度對總多酚質(zhì)量濃度的影響

2.1.5 發(fā)酵時間對黃花菜酵素總糖、總酸、總多酚質(zhì)量分數(shù)的影響

從圖9和圖10可以看出：前2 d總糖質(zhì)量分數(shù)增加，這可能是發(fā)酵前期總糖在高滲透壓下從黃花菜中溶至發(fā)酵液中，溶出速率大于降解速率；2 d后總糖持續(xù)下降，總酸質(zhì)量分數(shù)迅速增加，說明原料迅速發(fā)酵，總糖降解快速，同時總酚質(zhì)量濃度快速增加，說明發(fā)酵過程可以顯著提高酵素中的總酚質(zhì)量濃度；發(fā)酵至第6天時，總酸質(zhì)量分數(shù)與多酚質(zhì)量濃度達到最大值，之后趨于穩(wěn)定。綜合考慮，發(fā)酵時間選擇6 d。除黃花菜酵素外，已有報道表明在藍莓酵素、葡萄酵素天然發(fā)酵過程中總酚質(zhì)量分數(shù)呈逐漸上升趨勢，發(fā)酵結(jié)束后二者的總酚質(zhì)量濃度分別為1.74和2.31 mg/mL[4-5]。

圖9 發(fā)酵時間對總糖、總酸質(zhì)量分數(shù)的影響

圖10 發(fā)酵時間對總多酚質(zhì)量濃度的影響

2.2 響應(yīng)面試驗

2.2.1 試驗設(shè)計方案及結(jié)果

響應(yīng)面試驗設(shè)計及統(tǒng)計結(jié)果見表2。利用統(tǒng)計軟件Design-Expert 8.0.6.1進行試驗設(shè)計和數(shù)據(jù)分析[6]。

表2 Box-Benhnken試驗設(shè)計及響應(yīng)值的實測值

2.2.2 模型方程的建立及變量分析

利用統(tǒng)計軟件Design Expert對試驗數(shù)據(jù)進行分析，可得到各因素與總酸、總多酚質(zhì)量分數(shù)之間的回歸方程式，通過對響應(yīng)面數(shù)據(jù)進行回歸分析，擬合后得到二次多項回歸方程（1）和（2）：

由表3可知[7]：從方差分析可見，試驗所選用的二次多項模型具有高度的顯著性（p＜0.0001），總酸校正決定系數(shù)（R2）為0.993，總多酚校正決定系數(shù)（R2）為0.9795，表明應(yīng)變量與自變量之間的多元回歸關(guān)系顯著，此模型擬合度好，說明試驗設(shè)計合理，該回歸模型可代替試驗真實點設(shè)計試驗。因此在確定最佳工藝時，以總酸、總多酚作為主要考察對象，通過對回歸系數(shù)的校驗，影響產(chǎn)品總酸的因素主次順序為發(fā)酵時間＞接種量＞發(fā)酵溫度；影響產(chǎn)品總多酚的因素主次順序為發(fā)酵時間＞接種量＞發(fā)酵溫度。

表3 回歸模型方差分析

2.3 交互作用分析

2.3.1 三因素對產(chǎn)品總酸的影響

為了研究三因素的變化與響應(yīng)值之間的關(guān)系，通過固定一個因素為0水平，研究另外兩個因素的交互作用，得到三維立體圖。根據(jù)這些方程得到三因素的交互效應(yīng)三維立體圖和等高線圖，考察響應(yīng)面圖的形狀。等高線的形狀反映交互效應(yīng)的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形與之相反[9]。由圖11等高線圖可以看出：這3個因素間的交互作用不顯著，這與回歸模型方差分析的計算結(jié)果一致。隨著接種量增加，產(chǎn)品總酸先增加后減小，總酸質(zhì)量分數(shù)變化是由發(fā)酵過程中乙酸、乳酸等有機酸質(zhì)量分數(shù)增加所致[10]，因此菌種濃度在一定范圍內(nèi)會促進發(fā)酵反應(yīng)，總酸質(zhì)量分數(shù)增加，但是當增加到一定濃度時，菌種代謝消耗營養(yǎng)物質(zhì)大于代謝產(chǎn)物積累，因此總酸質(zhì)量分數(shù)減少；隨著發(fā)酵時間延長，總酸質(zhì)量分數(shù)不斷增加，說明發(fā)酵時間有利于總酸的積累；發(fā)酵溫度提高，總酸質(zhì)量分數(shù)是先增大后減小的。

圖11 三因素對產(chǎn)品總酸的影響

2.3.2 三因素對產(chǎn)品總多酚的影響

總多酚是產(chǎn)品潛在功能性的表現(xiàn)，很多研究表明多酚類物質(zhì)在抗誘變、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化等方面具有顯著的作用[11]。黃花菜多酚對羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH 自由基均具有一定的清除作用，且清除率與黃花菜多酚濃度呈量效關(guān)系[12]，因此盡可能保留總多酚質(zhì)量分數(shù)對黃花菜發(fā)酵具有重要意義。

從圖12等高線圖可看出：接種量與發(fā)酵溫度近似圓形，因此交互作用不明顯，接種量與發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間呈橢圓形，有一定的交互作用。從圖12響應(yīng)面圖可知：隨著接種量增加，產(chǎn)品總多酚先增加后減小，這是由于菌種濃度在一定范圍內(nèi)會促進發(fā)酵反應(yīng)，總酸質(zhì)量分數(shù)增加，但是當增加到一定濃度時，菌種代謝消耗營養(yǎng)物質(zhì)大于代謝產(chǎn)物積累，因此總酸質(zhì)量分數(shù)減少；隨著發(fā)酵時間延長，總多酚質(zhì)量濃度不斷增加，說明發(fā)酵時間有利于總多酚的積累，但是發(fā)酵后期總多酚濃度分數(shù)減少，原因可能是時間過長，多酚發(fā)生降解、氧化等化學(xué)反應(yīng)致使多酚分子結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的破壞；發(fā)酵溫度提高，總多酚質(zhì)量濃度先增大后減小。

圖12 三因素對產(chǎn)品總多酚質(zhì)量濃度的影響

2.4 最佳工藝條件下驗證試驗

為了驗證模型的有效性，利用SAS 8.0軟件的優(yōu)化功能，得到發(fā)酵液接種量0.53%、發(fā)酵溫度37.5 ℃、發(fā)酵時間6.2 d。在最優(yōu)工藝條件下進行驗證性試驗，由表4可知，總酸、總多酚實測值與預(yù)測值相差較小，對結(jié)果進行修正，說明此模型有效。

表4 最佳工藝條件下驗證試驗

3 結(jié)論

以黃花菜乳酸發(fā)酵總糖、總酸、總多酚為評價指標，通過單因素試驗考察5個因素對產(chǎn)品品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，料液比6%，蔗糖添加量3%，菌種接種量0.5%，在37 ℃下發(fā)酵6 d，效果較好。利用Box-Behnken統(tǒng)計學(xué)試驗設(shè)計方法建立了總酸、總多酚的二次多項數(shù)學(xué)模型。影響產(chǎn)品總酸的因素主次順序為發(fā)酵時間＞接種量＞發(fā)酵溫度；影響產(chǎn)品總多酚的因素主次順序為發(fā)酵時間＞接種量＞發(fā)酵溫度。通過對模型方程3D圖及其等高線圖的分析，明確了因素間交互作用并獲得了最佳處理條件。結(jié)果表明：發(fā)酵時間、接種量、發(fā)酵溫度對總酸的影響交互作用不顯著；接種量與發(fā)酵溫度對總多酚的影響交互作用不明顯，接種量與發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間對總多酚的影響有一定的交互作用。利用模型方程可以預(yù)測黃花菜乳酸發(fā)酵總酸質(zhì)量分數(shù)、總多酚質(zhì)量濃度變化趨勢，方程預(yù)測值與實際值之間具有較好的擬合度，其最優(yōu)工藝參數(shù)為接種量0.53%、發(fā)酵溫度37.5 ℃、發(fā)酵時間6.2 d，在此條件下總酸實測值為18.7 g/kg，總多酚實測值為83.4 mg/100 mL。