高活性納豆固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化及納豆口含片制備

王晶，劉鵬莉

煙臺(tái)職業(yè)學(xué)院（煙臺(tái) 264670）

納豆是在熟大豆中接種枯草芽孢桿菌或者納豆菌發(fā)酵制成的產(chǎn)品，具有一定的保健功效[1]。納豆源于中國(guó)，在奈良、平安時(shí)代由禪僧傳入日本。古書《和漢三才圖會(huì)》記載：納豆自中國(guó)秦漢以來開始制作。最初生產(chǎn)納豆是利用稻草上的芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵，在寺廟的廚房制造，因?yàn)樗聫R的廚房叫“納所”，所以稱為納豆。

新鮮發(fā)酵的納豆具有金黃色的色澤，口感酥軟，表面布滿黏稠的液體。每百克納豆中含31.2 g蛋白質(zhì)、19.9 g脂肪、22.8 g碳水化合物、331 mg鈣、13.7 mg鐵[2]。大量研究結(jié)果表明，納豆不但能夠有效預(yù)防和治療心腦血管疾病[3-4]，還具有保肝護(hù)肝、抗腫瘤、抗氧化以及延緩衰老等多種功效[5-7]。納豆的保健功能主要與其中的納豆激酶有關(guān)。納豆激酶是納豆在發(fā)酵過程中由菌體產(chǎn)生一種絲氨酸蛋白酶，1987年日本須見洋行首次發(fā)現(xiàn)該酶[8]。納豆中含有的納豆激酶具有很好的溶栓效果[9-10]，經(jīng)常食用納豆可有效地預(yù)防心腦血管疾病的發(fā)生。納豆的保健功能與納豆激酶的活性密切相關(guān)，通過優(yōu)化發(fā)酵工藝提高納豆激酶活性可有效增強(qiáng)納豆的保健功能。

北京、天津等較大城市的少數(shù)企業(yè)已開始生產(chǎn)納豆，人們也開始慢慢了解納豆的營(yíng)養(yǎng)功效并嘗試食用。但是仍有許多消費(fèi)者不愿意接受市售納豆的特殊味道。試驗(yàn)從日本納豆中分離到的高活性納豆激酶菌種，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化納豆固體發(fā)酵工藝，制備具有高活性的納豆，并采用冷凍升華干燥技術(shù)，粉碎后設(shè)計(jì)產(chǎn)品的配方，壓制成片。這種功能性產(chǎn)品適合大多數(shù)人的口味，能夠長(zhǎng)期保存，市場(chǎng)前景良好，可帶來良好社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

納豆桿菌（實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)藏）；優(yōu)質(zhì)大豆（煙臺(tái)）；N-對(duì)甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽（TAME，分析純，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司）；瓊脂粉（生化試劑，天津市北辰方正試劑廠）。

固體培養(yǎng)基：牛肉浸膏5 g/L，蛋白胨5 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂5 g/L，pH 7.2～7.4，0.1 MPa、121 ℃滅菌20 min。

液體培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，牛肉浸膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 3 g/L，pH 7.2～7.4，0.1 MPa、121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQG02手提式電熱壓力蒸汽消毒器（山東新華安得醫(yī)療用品有限公司）；TU-1810紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；SW-CJ-2G雙人凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DC140實(shí)驗(yàn)型單沖頭壓片機(jī)（上海達(dá)程實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化[11]

將納豆桿菌接種到平板培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。用接種環(huán)從平板上挑取一環(huán)菌體接入裝有液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，在37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)36 h。

1.3.2 納豆激酶活性測(cè)定

采用TAME法[12]測(cè)定納豆激酶活性。將0.1 mol/L TAME溶液、磷酸鹽緩沖液和樣品溶液各0.1 mL混合均勻，在37 ℃水浴加熱30 min。加入0.2 mL 15%三氯乙酸，混勻，依次加入0.1 mL 2%高錳酸鉀溶液和0.1 mL 10%亞硫酸鈉溶液，混合均勻。加入4.0 mL變色酸溶液，沸水浴加熱25 min，冷卻至室溫，測(cè)定574 nm處吸光度。以去離子水代替樣品溶液作為空白對(duì)照。

1.3.3 固態(tài)發(fā)酵制備納豆

選用顆粒飽滿、大小均勻、色澤黃亮、豆皮完整、無龜裂破損、無蟲眼、無霉變的大豆為原料，剔除異物、沙土等雜質(zhì)，用蒸餾水沖洗干凈，在20 ℃下浸泡12 h，瀝干水分。將浸泡好的大豆放入電熱壓力蒸汽消毒器中，于121 ℃、0.1 MPa加熱10 min，冷卻至室溫。將蒸煮好的大豆放在超凈工作臺(tái)中紫外照射滅菌20 min，接入納豆菌液。將接種好的大豆放于37℃恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h。發(fā)酵結(jié)束后，取出納豆，冷卻至室溫，置于冰箱中4 ℃后熟24 h。

1.3.4 納豆口含片制備

將后熟好的納豆取出，于-51 ℃預(yù)凍30 min，然后冷凍干燥。將凍干后的納豆放入粉碎機(jī)中粉碎，將納豆磨成粉末。制成的納豆粉末具有濃烈的臭味，向納豆粉末中添加葡萄糖、食鹽、環(huán)狀糊精、卡拉膠等添加劑對(duì)臭味進(jìn)行掩蓋。將混合后的粉末放入壓片機(jī)中，壓制成片。

1.3.5 納豆口含片感官評(píng)價(jià)

選擇10人組成感官評(píng)價(jià)小組，對(duì)納豆口含片的風(fēng)味進(jìn)行評(píng)定。感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 納豆口含片感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.6 納豆固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

1.3.6.1 單因素試驗(yàn)

采用單因素試驗(yàn)考察大豆浸泡pH、大豆含水量、接種量、物料厚度和碳源種類對(duì)發(fā)酵納豆中納豆激酶活性的影響。各因素水平設(shè)定情況如表2所示。各因素固定水平為大豆浸泡pH 6、大豆含水量65%、接種量9%、物料厚度2 cm、無碳源。

表2 固態(tài)發(fā)酵單因素試驗(yàn)因素與水平

1.3.6.2 正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，分析選取對(duì)納豆激酶活性影響顯著的大豆浸泡pH（A）、接種量（B）、物料厚度（C）和碳源種類（D）4個(gè)因素，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，以納豆激酶活性作為評(píng)定指標(biāo)，對(duì)納豆固態(tài)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)的因素水平設(shè)定情況如表3所示。

表3 固態(tài)發(fā)酵正交試驗(yàn)因素與水平

1.3.7 納豆口含片配方優(yōu)化

1.3.7.1 單因素試驗(yàn)

采用單因素試驗(yàn)考察葡萄糖、食鹽、環(huán)狀糊精和卡拉膠的添加量對(duì)納豆口含片感官品質(zhì)的影響。單因素試驗(yàn)因素與水平如表4所示。

表4 納豆口含片單因素試驗(yàn)因素與水平 單位：%

1.3.7.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以納豆口含片感官評(píng)價(jià)得分作為響應(yīng)值，以葡萄糖添加量（A）、食鹽添加量（B）、環(huán)狀糊精添加量（C）和卡拉膠添加量（D）作為因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，對(duì)納豆口含片配方進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)的因素水平設(shè)定情況如表5所示。

表5 納豆口含片響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平 單位：%

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Excel 2018進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)均通過3次獨(dú)立試驗(yàn)獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 納豆固態(tài)發(fā)酵單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 大豆浸泡pH對(duì)納豆激酶活性的影響

大豆初始pH直接影響細(xì)胞的代謝活動(dòng)，還影響大豆中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度，從而間接影響納豆菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用，對(duì)納豆激酶產(chǎn)量及活性造成影響[11]。如圖1所示：在弱酸性條件下浸泡大豆，發(fā)酵所得納豆激酶活性較高，大豆浸泡pH 6時(shí)，發(fā)酵獲得的納豆具有最高活性。隨著pH升高，納豆激酶活性呈波浪狀下降趨勢(shì)。大豆浸泡pH 7時(shí)，發(fā)酵所得納豆激酶活性最低。

圖1 浸泡pH對(duì)納豆激酶活性的影響

2.1.2 大豆含水量對(duì)納豆激酶活性的影響

如圖2所示：納豆激酶活性隨大豆含水量增加而增加，含水量超過55%時(shí)，納豆激酶活性隨含水量增大趨勢(shì)變緩。含水量影響納豆菌的生長(zhǎng)狀態(tài)從而影響產(chǎn)酶量[13]。含水量過低時(shí)，納豆菌生長(zhǎng)受到限制。

圖2 含水量對(duì)納豆激酶活性的影響

2.1.3 接種量對(duì)納豆激酶活性的影響

如圖3所示：納豆激酶活性隨接種量增加先降低后升高。接種量3%時(shí)，產(chǎn)品納豆激酶活性具有最大值，接種量9%時(shí)，納豆激酶活性最低。此結(jié)果與田莉等[14]的研究結(jié)果相似。當(dāng)接種量少時(shí)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足，菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶均不受限制，產(chǎn)酶量高[15]。接菌量過高時(shí)，可能造成前期菌體生長(zhǎng)過快，消耗的基質(zhì)較多，相應(yīng)地產(chǎn)酶所需的養(yǎng)分就少，產(chǎn)酶量下降，并且菌體之間存在競(jìng)爭(zhēng)。接種量超過9%后，隨著接種量增加，雖然單個(gè)菌體的產(chǎn)酶量下降，但菌體總數(shù)在增加，從而產(chǎn)酶總量增加，但會(huì)造成菌體浪費(fèi)。

圖3 接種量對(duì)納豆激酶活性的影響

2.1.4 物料厚度對(duì)納豆激酶活性的影響

由圖4可知：納豆激酶活性隨物料厚度先減小后增加。物料厚度1 cm時(shí)，發(fā)酵所得納豆中納豆激酶活性最高，物料厚度3 cm時(shí)，納豆激酶活性最低。發(fā)酵厚度增加造成氧氣供應(yīng)受阻，因而影響納豆菌的生長(zhǎng)。物料厚度超過3 cm時(shí)，繼續(xù)增大物料厚度，物料總量增加，接種的菌體總量也隨之增加，雖然單個(gè)菌體產(chǎn)酶量降低，但接入菌體的產(chǎn)酶總量增加。

圖4 物料厚度對(duì)納豆激酶活性的影響

2.1.5 碳源種類對(duì)納豆激酶活性的影響

由圖5可知：以甘油作為碳源，發(fā)酵所得納豆激酶活性最高；以木糖、蔗糖為碳源，納豆激酶活性與空白組無顯著差別；添加麥芽糖為碳源，納豆激酶活性降低，說明麥芽糖不利于納豆發(fā)酵產(chǎn)酶。該結(jié)果與郭海勇等[16]研究結(jié)果存在差異。郭海勇等研究表明，麥芽糖為最佳碳源，添加甘油、木糖后，產(chǎn)酶活力下降。這種差異可能與試驗(yàn)菌種不同有關(guān)。

圖5 碳源種類對(duì)納豆激酶活性的影響

2.2 納豆固態(tài)發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取浸泡pH（A）、接種量（B）、物料厚度（C）、碳源種類（D）4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，以納豆激酶活性作為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)因素結(jié)果見表6。

由表6可知，4個(gè)因素對(duì)納豆激活活性的影響程度為碳源＞接種量＞pH＞物料厚度，即碳源種類的影響最大。納豆固態(tài)發(fā)酵條件最優(yōu)組合為D1B2A1C3，即碳源采用甘油，接種量6%，pH 5，物料厚度3 cm。

表6 納豆固態(tài)發(fā)酵響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3 納豆含片單因素試驗(yàn)

2.3.1 葡萄糖添加量的確定

取5份納豆凍干粉，分別向其中加入納豆粉末質(zhì)量2.0%，4.0%，6.0%，8.0%和10.0%的葡萄糖，混合均勻。按照表1的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果見表7。

表7 葡萄糖添加量對(duì)納豆粉末口味的影響

2.3.2 食鹽添加量的確定

取5份納豆凍干粉，分別向其中加入納豆粉末質(zhì)量2.0%，4.0%，6.0%，8.0%和10.0%食鹽，混合均勻。按照表1的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果見表8。

表8 食鹽添加量對(duì)納豆粉末口味的影響

2.3.3 環(huán)狀糊精添加量的確定

取5份納豆凍干粉，分別向其中加入納豆粉末質(zhì)量2.0%，4.0%，6.0%，8.0%和10.0%的環(huán)狀糊精，混合均勻。按照表1的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果見表9。

表9 環(huán)狀糊精添加量對(duì)納豆粉末口味的影響

2.3.4 卡拉膠添加量的確定

取5份納豆凍干粉，分別向其中加入納豆粉末質(zhì)量2.0%，4.0%，6.0%，8.0%和10.0%的卡拉膠，混合均勻。按照表1的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果見表10。

表10 卡拉膠添加量對(duì)納豆粉末口味的影響

2.4 正交試驗(yàn)確定納豆粉末調(diào)味配方

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取葡萄糖添加量、食鹽添加量、環(huán)狀糊精添加量、卡拉膠添加量作為正交試驗(yàn)的4個(gè)因素對(duì)納豆口含片配方進(jìn)行優(yōu)化，確定納豆粉調(diào)味的最佳添加組合。試驗(yàn)結(jié)果如表11所示。

表11 納豆含片配方正交試驗(yàn)結(jié)果

4個(gè)影響因子對(duì)納豆含片感官評(píng)分的影響程度為卡拉膠添加量＞環(huán)狀糊精添加量＞葡萄糖添加量=食鹽添加量?？ɡz添加量的影響最大。納豆口含片最優(yōu)配方組合為D2C3A1B2，即卡拉膠添加量4.0%、環(huán)狀糊精6.0%添加量、葡萄糖添加量6.0%、食鹽添加量6.0%。

3 結(jié)論

試驗(yàn)對(duì)納豆的固態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，采用冷凍升華干燥法對(duì)納豆進(jìn)行干燥處理，保護(hù)納豆激酶的活性不被破壞，并對(duì)納豆口含片的配方進(jìn)行研究，確定納豆發(fā)酵的最佳條件和納豆臭味掩蓋的配方。納豆固態(tài)發(fā)酵條件為大豆浸泡pH 5，接種量6%，物料厚度3 cm，使用甘油作為碳源。納豆口含片配方為卡拉膠4.0%，環(huán)狀糊精6.0%，葡萄糖6.0%，食鹽6.0%。用優(yōu)化后的發(fā)酵條件生產(chǎn)的納豆顏色艷亮油光澤，口感酥軟，濕潤(rùn)，拉絲效果好，黏度很大，并有納豆特有香氣。干納豆粉碎后進(jìn)行調(diào)味，臭味明顯得到改善，口味易于接受。