木耳菌糠半纖維素水解制備還原糖

于夢(mèng)堯，鄭喜群，劉曉蘭，王艷菊，甄珍，錢朋智

1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院（齊齊哈爾 161006）；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院（大慶 163711）；3.黑龍江省哈爾濱海關(guān)技術(shù)中心齊齊哈爾綜合實(shí)驗(yàn)室（齊齊哈爾 161000）

中國(guó)是食用菌生產(chǎn)、消費(fèi)大國(guó)，生產(chǎn)食用菌的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量培養(yǎng)基廢料（菌糠），對(duì)食用菌的持續(xù)發(fā)展帶來挑戰(zhàn)[1]。因此，合理處理食用菌菌糠，實(shí)現(xiàn)廢物再利用、變廢為寶成為研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，食用菌菌糠中含有多種水溶性養(yǎng)分和豐富的有機(jī)物質(zhì)，根據(jù)基質(zhì)的不同，粗纖維占10%～30%，粗蛋白占5%～15%，且含有一定量的微量元素[3-6]。食用菌菌糠的資源化利用受到廣泛關(guān)注，已報(bào)道的利用途徑有10余種[7]，多集中于動(dòng)物飼料[8]、食用菌的二次栽培[9-10]、改良土壤[11]、能源材料[12]等方面。

半纖維素是自然界中最豐富的可再生生物資源之一[13]，是一類復(fù)合聚糖的總稱，主要是由木糖、阿拉伯糖和葡萄糖等多種還原糖構(gòu)成的功能性聚糖[14]。相關(guān)研究表明，木糖和阿拉伯糖等作為功能性還原糖，具有獨(dú)特的生理功能，在食品、飼料和醫(yī)藥方面具有廣泛的用途[15-16]，在營(yíng)養(yǎng)與保健、畜牧養(yǎng)殖、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)及抗病害等方面具有極大的潛力[17]。菌糠半纖維素的功能性還原糖開發(fā)是探索菌糠合理利用的途徑之一[18]。但是關(guān)于菌糠功能性還原糖研究的相關(guān)報(bào)道較少，若能合理分析、研究和利用這些半纖維素，不僅可以實(shí)現(xiàn)廢物的循環(huán)利用，減少環(huán)境污染，同時(shí)還可增加經(jīng)濟(jì)效益，具有重要的研究?jī)r(jià)值。

以木耳菌糠為原料，采用高溫蒸煮對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理，優(yōu)化預(yù)處理?xiàng)l件，以達(dá)到去除雜質(zhì)的目的；以低濃度稀酸溶液作為催化介質(zhì)，研究木耳菌糠半纖維素的降解技術(shù)，優(yōu)化水解條件，獲得半纖維素還原糖；應(yīng)用D301弱陰離子交換層析、001×7強(qiáng)陽(yáng)離子交換層析聯(lián)合D201強(qiáng)陰離子交換層析對(duì)所得半纖維素還原糖進(jìn)行分離純化，采用高效液相色譜（HPLC）對(duì)半纖維素還原糖組成進(jìn)行測(cè)定，以期為食用菌菌糠半纖維素還原糖結(jié)構(gòu)解析及功能性產(chǎn)品的研究開發(fā)提供初步理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

木耳菌糠，齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院微生物培養(yǎng)室提供，粉碎后過0.425 mm（40目）孔徑篩，取篩下物，備用；D301弱陰離子交換樹脂、001×7強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹脂及D201強(qiáng)陰離子交換樹脂（浙江爭(zhēng)光實(shí)業(yè)股份有限公司）；3種單糖標(biāo)準(zhǔn)品：D（+）-葡萄糖（glucose，Glu）、D（+）-木糖（xylose，Xyl）、L-阿拉伯糖（arabinose，Ara），山東龍力生物科技股份有限公司；氫氧化鈉、四水酒石酸鉀鈉、硫酸銅、亞鐵氰化鉀、葡萄糖、濃鹽酸等（均為國(guó)產(chǎn)分析純）；濃硫酸（國(guó)產(chǎn)色譜純）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械有限公司）；布氏漏斗裝置（蜀牛玻璃儀器有限公司）；手持折光計(jì)（成都泰華光學(xué)有限公司）；有機(jī)玻璃離子交換柱（江蘇金三陽(yáng)水處理科技江蘇有限公司）；BIO RAD Aminex HPX-87H色譜柱（美國(guó)伯樂公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝總路線

木耳菌糠→粉碎至0.425 mm（40目）→高溫預(yù)處理→低濃度稀硫酸溶液水解→離子交換樹脂分離純化→高效液相色譜色譜分析單糖組成

1.3.2 木耳菌糠高溫預(yù)處理?xiàng)l件單因素試驗(yàn)

以蒸煮溫度（108，113，118，123和128 ℃）、蒸煮時(shí)間（15，30，60，90和120 min）、固液比（1∶5，1∶8，1∶10，1∶15和1∶20 g/mL）為單因素，以雜質(zhì)去除率和總還原糖損失率為指標(biāo)，篩選木耳菌糠最佳預(yù)處理?xiàng)l件。每個(gè)處理稱取50 g木耳菌糠（干基）。

1.3.3 木耳菌糠水解條件單因素試驗(yàn)

取等量預(yù)處理后的物料，以固液比（1∶5，1∶8，1∶10，1∶15和1∶20 g/mL）、硫酸濃度（0.5%，1.0%，1.2%，1.5%和2.0%）、水解溫度（108，113，118，123和128 ℃）、水解時(shí)間（60，90，120，150和180 min）為單因素，以還原糖得率為指標(biāo)，選出最佳木耳菌糠水解條件。每個(gè)處理稱取50 g木耳菌糠（干基）。

1.3.4 木耳菌糠半纖維素還原糖的分離純化

還原糖的分離純化方法參考張梅娟等[19]的方法。

1.3.5 木耳菌糠半纖維素還原糖的單糖組成分析

14種單糖標(biāo)準(zhǔn)液配制：配制質(zhì)量濃度1%的蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、甘露糖醇、阿拉伯醇、半乳糖醇、木糖醇、赤蘚糖醇和山梨醇，均置于4 ℃冰箱中備用，進(jìn)色譜柱之前用0.22 μm膜、超聲波脫氣處理。待測(cè)樣品的前處理及色譜條件參考張梅娟等[19]的方法。

1.3.6 木耳菌糠半纖維素還原糖相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

雜質(zhì)去除率和總還原糖損失率的測(cè)定、總還原糖含量的測(cè)定、糖液總還原糖得率的測(cè)定、糖液純度計(jì)算和電導(dǎo)率的測(cè)定方法參考張梅娟等[19]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 木耳菌糠預(yù)處理?xiàng)l件的研究

2.1.1 最佳蒸煮時(shí)間的選擇

預(yù)處理的目的是盡可能除去水解原料內(nèi)部雜質(zhì)，如果膠、脂肪、含氮物、灰分和色素等，同時(shí)盡可能減少還原物的損失，一般要求預(yù)處理后的還原物損失率不超過2%[20]。

由表1可知：隨著蒸煮時(shí)間延長(zhǎng)，木耳菌糠雜質(zhì)去除率逐漸升高，在120 min時(shí)可達(dá)23.27%，效果較好，但總還原糖的損失率也隨之增加。為使總還原糖損失不超過2%，從木耳菌糠雜質(zhì)去除率和總還原糖損失率綜合考慮，最佳蒸煮時(shí)間選擇30 min，此條件下總還原糖損失率為1.66%，雜質(zhì)去除率為18.15%。

表1 不同蒸煮時(shí)間對(duì)木耳菌糠預(yù)處理的影響

2.1.2 最佳蒸煮溫度的選擇

溫度不僅會(huì)影響雜質(zhì)的去除，而且會(huì)導(dǎo)致還原物的損失。由表2可知：隨著蒸煮溫度升高，木耳菌糠的雜質(zhì)去除率逐漸增加，在128 ℃時(shí)可達(dá)30.44%。溫度123 ℃時(shí)總還原糖損失率最高，為1.45%，溫度繼續(xù)增加，損失率開始降低，原因可能是蒸煮溫度過高，溶出的還原糖發(fā)生了副反應(yīng)，轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)。從木耳菌糠總還原糖雜質(zhì)去除率和損失率綜合考慮，最佳蒸煮溫度選擇123 ℃，此條件下總還原糖損失率為1.45%，雜質(zhì)去除率為23.11%。

表2 不同蒸煮溫度對(duì)木耳菌糠預(yù)處理的影響

2.1.3 最佳預(yù)處理固液比的選擇

從表3可看出：不同固液比對(duì)木耳菌糠雜質(zhì)去除率和總還原糖損失率的影響不同。固液比1∶20（g/mL）時(shí)，雜質(zhì)去除率最高，可達(dá)39.34%。隨著固液比的增加，總還原糖損失率先升高后降低，可能是溶出的還原糖轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)。雖然固液比1∶20（g/mL）時(shí)的雜質(zhì)去除率比固液比1∶8（g/mL）時(shí)雜質(zhì)去除率高，但相應(yīng)的還原糖損失率也高，因此，從木耳菌糠總還原糖損失率和雜質(zhì)去除率、生產(chǎn)成本、能耗等多方面綜合考慮，選擇1∶8（g/mL）為最佳固液比。

表3 不同固液比對(duì)木耳菌糠預(yù)處理的影響

結(jié)果表明，木耳菌糠最佳預(yù)處理?xiàng)l件為蒸煮溫度123 ℃、蒸煮時(shí)間30 min、固液比1∶8（g/mL）。

2.2 木耳菌糠水解條件的研究

2.2.1 固液比對(duì)木耳菌糠水解液還原糖得率的影響

由圖1可知：固液比對(duì)木耳菌糠水解液還原糖的得率有一定程度的影響。還原糖得率隨著固液比的增加而升高，達(dá)到最大值后隨著固液比的增加又逐漸降低。固液比1∶8（g/mL）時(shí)，得率最高，可達(dá)13.98%，與其他固液比相比，差異顯著。這說明在低固液比（1∶5和1∶8 g/mL）時(shí)，水解反應(yīng)速度增加較快，但固液比達(dá)到一定程度時(shí)，反應(yīng)速度開始緩慢。因此，從生產(chǎn)成本等多方面考慮，最佳固液比選擇1∶8（g/mL）。

圖1 固液比對(duì)木耳菌糠水解液還原糖得率的影響

2.2.2 硫酸濃度對(duì)木耳菌糠水解液還原糖得率的影響

由圖2可知：木耳菌糠水解液還原糖得率隨著溶液中硫酸濃度增大呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)。硫酸濃度1.2%時(shí)，水解液還原糖得率最高，為14.51%；硫酸濃度大于1.2%時(shí)，還原糖得率降低。易守連等[21]在研究玉米芯纖維素、半纖維素分離及水解成可發(fā)酵性糖時(shí)發(fā)現(xiàn)，酸濃度增大會(huì)導(dǎo)致纖維素碳化。試驗(yàn)中硫酸濃度過高時(shí)還原糖得率降低，分析原因是硫酸濃度過高導(dǎo)致半纖維素被碳化。因此，最佳硫酸濃度選擇1.2%。

圖2 硫酸濃度對(duì)木耳菌糠水解液還原糖得率的影響

2.2.3 溫度對(duì)木耳菌糠水解液還原糖得率的影響

溫度是影響水解的主要條件因素之一。由圖3可知：溫度對(duì)木耳菌糠水解液還原糖得率的影響較大。隨著溫度升高，還原糖得率呈現(xiàn)波動(dòng)趨勢(shì)。在123 ℃時(shí)達(dá)到最大值，為13.86%。在較高溫度（128 ℃）下還原糖發(fā)生降解，得率下降。因此選取123 ℃作為最佳溫度。

圖3 溫度對(duì)木耳菌糠水解液還原糖得率的影響

2.2.4 時(shí)間對(duì)木耳菌糠水解液還原糖得率的影響

在保證水解效果的同時(shí)縮短水解時(shí)間可以提高還原糖的生產(chǎn)效率。由圖4可以看出：水解時(shí)間低于90 min時(shí)，還原糖得率較低，均低于10%；隨著水解時(shí)間延長(zhǎng)，還原糖得率增加迅速，在150 min時(shí)達(dá)到最大值，為14.31%，說明隨著時(shí)間延長(zhǎng)，木耳菌糠中的半纖維素得到充分水解。水解時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，還原糖得率顯著下降，這可能是因?yàn)檫^長(zhǎng)的水解時(shí)間引起副反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致非糖物質(zhì)增加，所以最佳水解時(shí)間選擇150 min。

圖4 時(shí)間對(duì)木耳菌糠水解液還原糖得率的影響

結(jié)果表明，木耳菌糠最佳水解條件為固液比1∶8（g/mL）、硫酸濃度1.2%、水解溫度123 ℃、水解時(shí)間150 min。

2.3 分離純化

由表4可知：木耳菌糠半纖維素水解液經(jīng)D301離子交換層析后，電導(dǎo)率有一定程度的降低，水解糖純度進(jìn)一步升高，總還原糖損失率為2.55%；D301離子交換層析收集的糖液經(jīng)001×7離子交換層析后，電導(dǎo)率持續(xù)降低，水解糖純度再一次升高，總還原糖的損失率為2.71%；001×7離子交換層析收集的糖液經(jīng)D201離子交換層析后，水解糖純度持續(xù)升高，總還原糖損失率為2.64%，從D201離子交換層次收集的糖液電導(dǎo)率為95 μS/cm，純度為88.74%。

表4 木耳菌糠半纖維素水解糖純化結(jié)果

2.4 木耳菌糠半纖維素還原糖的單糖組分分析

糖類分析的主要目的是單糖、寡糖的組成和多糖的分子量及其分布。糖類物質(zhì)的分離可以通過HPLC在色譜柱中實(shí)現(xiàn)。采用BIO RAD Aminex HPX-87H高效液相色譜法可確定14種單糖標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間，結(jié)果如表5所示。

表5 14種單糖標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間

采用BIO RAD Aminex HPX-87H高效液相色譜法對(duì)木耳菌糠半纖維素還原糖的單糖組成進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知：木耳菌糠半纖維素水解糖高效液相色譜圖中出現(xiàn)3個(gè)主峰，保留時(shí)間與前期預(yù)試驗(yàn)中蔗糖、乳糖、甘露糖、半乳糖、果糖、半乳糖醇、甘露糖醇、山梨醇、赤蘚糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇等11種標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間不同，而與D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)品出峰保留時(shí)間一致，表明木耳菌糠半纖維素水解液還原糖主要由D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖組成，其中D-木糖含量最高，各單糖物質(zhì)的量比為1.00∶4.68∶0.85。

圖5 木耳菌糠半纖維素還原糖高效液相色譜圖

3 結(jié)論

通過單因素五水平試驗(yàn)，得出木耳菌糠制備半纖維素還原糖的最優(yōu)預(yù)處理?xiàng)l件：蒸煮溫度123 ℃、蒸煮時(shí)間30 min、固液比1∶8（g/mL）。通過單因素五水平試驗(yàn)，木耳菌糠最佳水解條件為水解固液比1∶8（g/mL）、硫酸濃度1.2%、水解溫度123 ℃、水解時(shí)間150 min。

木耳菌糠半纖維素水解液采用D301弱陰離子交換層析、001×7強(qiáng)陽(yáng)離子交換層析及D201強(qiáng)陰離子交換層析的方法可起到很好的分離純化效果。采用HPLC對(duì)木耳菌糠半纖維素水解糖進(jìn)行分析，通過與單糖標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間進(jìn)行對(duì)比分析，確定木耳菌糠半纖維素還原糖是由D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖3種單糖按照不同比例縮合而成的，各單糖物質(zhì)的量比為1.00∶4.68∶0.85。

國(guó)內(nèi)外針對(duì)食用菌菌糠半纖維素的研究較少，若能合理分析、研究和利用這些半纖維素，不僅可以實(shí)現(xiàn)廢物的循環(huán)利用，減少環(huán)境污染，同時(shí)還可以增加經(jīng)濟(jì)效益，值得進(jìn)一步研究。試驗(yàn)對(duì)木耳菌糠的預(yù)處理、半纖維素的水解、水解液的分離純化、還原糖的單糖組成等進(jìn)行研究，以期為食用菌菌糠半纖維素還原糖結(jié)構(gòu)解析及功能性產(chǎn)品的研究開發(fā)提供初步理論依據(jù)。