萊菔硫烷下調(diào)miR-200c啟動(dòng)子甲基化水平抑制肺腺癌干細(xì)胞的干性特征

梁廣霞，覃喜團(tuán)，謝維，謝有科

0 引言

肺癌是我國發(fā)病率和病死率均位居前列的惡性腫瘤[1]。非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是最常見的肺癌亞型，占肺癌病例的85%[2]。腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells,CSCs）是惡性腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的主要原因，具有自我更新、無限增殖和形成異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞亞群。CSCs對(duì)幾乎所有常規(guī)腫瘤藥物具有抗藥性或不敏感，能在多數(shù)現(xiàn)有腫瘤治療手段中存活下來并引起腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。CSCs通過活化多種不同信號(hào)通路，如

Wnt/β-catenin、Sonic Hedgehog、Notch、PI3K/Akt/mTOR、STAT3等，獲得強(qiáng)大的存活能力。醛脫氫酶1（ALDH1）、致癌微RNA及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[3]也參與了CSCs的干性維持和存活調(diào)控。以CSCs為靶點(diǎn)的藥物研究為腫瘤臨床治療提供新的治療思路[4]。

萊菔硫烷（sulforaphane,SFN）是從綠花椰菜或其幼芽中提取的一種經(jīng)葡糖異硫氰酸鹽轉(zhuǎn)化的天然化合物，其預(yù)防和抗腫瘤的效果在乳腺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、肺癌等多種惡性腫瘤中得到證實(shí)[5-8]。本課題組前期研究表明，SFN不僅能有效抑制肺癌細(xì)胞的增殖能力，還能在較低藥物濃度下特異地抑制肺癌干細(xì)胞的增殖；SFN處理后伴隨著細(xì)胞內(nèi)大量miRNAs改變[8-9]，推測SFN可能通過調(diào)控肺癌干細(xì)胞miRNAs轉(zhuǎn)錄水平而介導(dǎo)肺癌干細(xì)胞的活性，但SFN與miRNAs的相互作用關(guān)系至今仍不清楚。本研究旨在探索SFN在抑制肺癌干細(xì)胞的干性和EMT特征過程中miRNA的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑

萊菔硫烷購于美國Sigma公司；鼠抗人β-catenin、Klf4、c-myc和E-cadherin等單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。萊菔硫烷用DMSO溶解分裝并貯存在-20℃冰箱中待用。miR-200c拮抗物（iRNA-200c）由上海凱基生物科技公司合成，PCR引物由美國Invitrogen公司合成，F(xiàn)irst strand cDNA synthesis Kit和QPCR premix（SYB）購于美國Fermantas公司，AseⅠ、Hind Ⅲ等核酸內(nèi)切酶購于美國NEB公司，psiCHECH-2購于美國Promega公司。

1.2 細(xì)胞株

人肺癌細(xì)胞株H460和A549購于中科院上海細(xì)胞中心，常規(guī)培養(yǎng)備用，在10%新生牛血清DMEM 高糖培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)及備用。腫瘤球培養(yǎng)以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。iRNA-200c轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞使用Lipofectamine2000（美國Thermo Fisher Scientific公司），按產(chǎn)品說明書操作。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長期。

1.3 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

貼壁細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后制備單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為（1.0～1.5）×104個(gè)/毫升，加入96孔板中，每孔200 μl，即2 000～3 000個(gè)/孔，共9孔。設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)過夜后（12 h以上）加入不同濃度SFN（0、0.5、1.0、5.0、10、12.5、15、20 μmol/L）處理72 h。加入噻唑藍(lán)（MTT），MTT終濃度為5.0 mg/ml，孵育4 h后棄上清液，加入DMSO，每孔200 μl，37℃恒溫?fù)u床振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定各孔吸光度值。

1.4 腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后以1 000 r/min離心2 min，棄上清液。以無菌PBS反復(fù)離心、洗滌3次后加入無血清培養(yǎng)液，制備單細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞密度為50個(gè)/毫升，將單細(xì)胞懸液按5毫升/孔均勻地轉(zhuǎn)移到超低黏附6孔板內(nèi)，進(jìn)行腫瘤球培養(yǎng)72 h。分為對(duì)照組和SFN-S組（5.0 μmol/L）。

1.5 蛋白印跡法實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞分為空白組和SFN-S組。按5×105個(gè)/毫升密度接種于200 ml培養(yǎng)瓶中，接種8 h貼壁后加入SFN（5.0 μmol/L）處理72 h，收獲細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白測量蛋白含量，置入-20℃冰箱備用。加入等量的3×SDS PAGE緩沖液，96℃恒溫水浴加熱5 min，各組取等量蛋白進(jìn)行12%SDS PAGE電泳并轉(zhuǎn)移到NC膜上，NC膜用5%脫脂奶粉4℃封閉2 h，TBST洗滌后將膜與稀釋的一抗置入4℃冰箱中孵育過夜，TBST液充分洗膜3次，每次振搖10 min。加入二抗室溫孵育2 h。沖洗除去未結(jié)合過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，TBST搖洗3次，每次8 min。取出NC膜應(yīng)用免疫發(fā)光反應(yīng)，在數(shù)字成像系統(tǒng)中顯影。

1.6 NGS測序法

腫瘤細(xì)胞以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)并加入不同濃度SFN（0、5.0 μmol/L），72 h后加入適量新鮮無血清培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后按600 r/min離心×3 min收獲腫瘤球。另取部分細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)72 h，以PBS洗滌3次后加入適量TRIzol裂解細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分組：常規(guī)培養(yǎng)Control組（貼壁細(xì)胞）、Sphere組（腫瘤球空白對(duì)照）和SFN-S組（以SFN處理腫瘤球），按不同細(xì)胞沉淀量加入適量TRIzol裂解細(xì)胞，在干冰條件下送測序公司，對(duì)細(xì)胞總miRNA進(jìn)行高通量測序。安諾優(yōu)達(dá)基因科技（北京）有限公司提供測序服務(wù)。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測

實(shí)驗(yàn)分為Control組、Sphere組（即腫瘤球不經(jīng)任何處理）和SFN-S組（以SFN處理腫瘤球）。SFN-S組在H460和A549細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)液（SFN終濃度5 μmol/L），對(duì)照組不作任何處理。常規(guī)培養(yǎng)72 h后使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA。利用SYBR Green試劑盒進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參。擴(kuò)增程序?yàn)?7℃ 3 min；95℃變性30 s，56℃退火20 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果以2-ΔΔCt表示。具體步驟參考產(chǎn)品說明。miR-200c引物序列如下：miR-200c-Forward：5'-GGTAATACTGCCGGGTAAT-3'，miR-200c-Reverse：5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'，退火溫度60℃，長度63bp。U6-Forward：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；U6-Reverse：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.8 構(gòu)建轉(zhuǎn)染miR-200c啟動(dòng)子-GFP質(zhì)粒與篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株

使用psiCHECH-2質(zhì)粒為模板，經(jīng)RT-PCR法獲得miR-200c CDS上游約350 bp啟動(dòng)子片段（序列兩端引入AseⅠ和HindⅢ兩種酶切位點(diǎn)），即：miR-200cAseI-F:5'-GAATTAATTC-GCCCGGTGA CAGGTAAAGG-3’；miR-200cHindⅢ-R:5'-CTA AGCTTAGCAAACACTGCTGGGTAAGACG-3’。將上述DNA片段重組到pEGFP質(zhì)粒GFP基因上游，獲得pEGFP-R200c質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)至感受態(tài)大腸桿菌后擴(kuò)增，所提取的質(zhì)粒DNA經(jīng)雙酶切后電泳并經(jīng)產(chǎn)物測序證實(shí)。pEGFP-R200c質(zhì)粒使用Lipofectamine2000試劑盒轉(zhuǎn)染到A549和H460細(xì)胞，經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。所得細(xì)胞株用于腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)和基因甲基化檢測。

1.9 細(xì)胞免疫熒光檢測

將一定數(shù)量的H460、A549細(xì)胞接種到預(yù)先放置無菌蓋玻片的6孔板，以10%新生牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)24 h后，對(duì)照組繼續(xù)培養(yǎng)，SFN-S組加入SFN處理，終濃度為5 μmol/L，處理72 h后取出，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，去垢劑0.1%triton X-100處理10 min，PBS洗3次。加入4%BSA封閉10 min；去除BSA后不需洗滌，加入一抗（濃度按預(yù)實(shí)驗(yàn)確定），37℃下孵育40 min。PBS洗3次，3分鐘/次，加入熒光二抗，37℃下孵育40 min。PBS洗3次，3分鐘/次，加入抗熒光猝滅封片劑和DAPI混合液（1:1，DAPI為原液），放置于熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.10 亞硫酸氫鹽法檢測基因甲基化水平

使用穩(wěn)定表達(dá)miR-200c啟動(dòng)子-GFP質(zhì)粒的A549細(xì)胞株，均以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)腫瘤球。實(shí)驗(yàn)分為3組：Sphere組（腫瘤球空白培養(yǎng)）、SFN-S組（SFN處理濃度為5 μmol/L）、5-氮雜胞苷組（5-氮雜胞苷濃度為0.5 μmol/L ）。收獲各組細(xì)胞DNA，加入亞硫酸氫鈉處理后備用。PCR擴(kuò)增亞硫酸氫鈉處理過的DNA樣品，將含有目的DNA片段的PCR產(chǎn)物重組到EGFP質(zhì)粒內(nèi)。設(shè)計(jì)PCR引物以擴(kuò)增miR-200c啟動(dòng)子中CpG豐富區(qū)域，跨度從轉(zhuǎn)錄啟始位點(diǎn)上游-315～ -169 bp，此段區(qū)域包含有9個(gè)CpG位點(diǎn)。甲基化引物為：-328～-303,Forward:5’-TAGGTAAAGGTTATTAGGGG AGAGG-3’；-142～ -165,Reverse:5’-ACCCAAA TTACAATCCAAACAAA-3’。DNA產(chǎn)物大小為185 bp，擴(kuò)增條件與PCR相同。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離并純化，后連接到載體pEGFP內(nèi)。挑取至少10個(gè)菌落進(jìn)行DNA測序以排除基因變異。使用JASPAR database（http://jaspar.binf.ku.dk/cgi-bin/）進(jìn)行miR-200c啟動(dòng)子序列的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測。驗(yàn)證序列的載體轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。常規(guī)進(jìn)行腫瘤球培養(yǎng)，使用SFN或5-Aza-dC進(jìn)行干預(yù)，72 h后收集腫瘤球并提取質(zhì)粒DNA，送檢測公司測序（實(shí)驗(yàn)重復(fù)10次），取所插入基因的主要甲基化位點(diǎn)甲基化程度平均值代表該組插入片段甲基化程度。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示并進(jìn)行單因素組間方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SFN有效抑制肺癌細(xì)胞的增殖活性

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SFN處理后，A549和H460細(xì)胞增殖活性呈劑量依賴性降低，在較低濃度（1.0 μmol/L）下即能發(fā)揮抗腫瘤增殖活性，H460和A549的IC50分別為12和10 μmol/L，見圖1。

圖1 MTT法檢測萊菔硫烷對(duì)肺癌細(xì)胞增殖活性的影響Figure 1 Effect of sulforaphane on viability of lung cancer cells detected by MTT method

2.2 SFN處理肺腺癌細(xì)胞腫瘤球后部分miRNAs出現(xiàn)差異性改變

與A549腫瘤球Sphere組比較，SFN-S組存在39個(gè)miRNAs轉(zhuǎn)錄水平增高，35個(gè)miRNAs轉(zhuǎn)錄水平下降（按變化>1倍）；在H460腫瘤球中，與Sphere組比較，SFN-S組出現(xiàn)22個(gè)miRNAs轉(zhuǎn)錄水平增高，31個(gè)miRNAs轉(zhuǎn)錄水平下降。其中，轉(zhuǎn)錄水平變化>10倍的miRNAs在A549腫瘤球SFN-S組存在15個(gè)miRNAs增高，4個(gè)miRNAs下降；H460腫瘤球SFN-S組存在17個(gè)miRNAs增高，6個(gè)miRNAs下降，見圖2、表1。

表1 萊菔硫烷處理肺癌腫瘤球后轉(zhuǎn)錄水平變化前10位miRNAsTable 1 Top 10 miRNAs with transcription level changes after sulforaphane treatment of lung cancer tumor spheres

圖2 萊菔硫烷處理肺癌細(xì)胞腫瘤球后差異表達(dá)miRNA的變化Figure 2 Changes of differentiated expression of miRNAs in lung cancer tumorospheres treated with sulforaphane

SFN處理A549和H460腫瘤球后miR-200c的轉(zhuǎn)錄變化水平最為明顯。進(jìn)一步行RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與Control組（貼壁細(xì)胞）相比，Sphere組miR-200c的轉(zhuǎn)錄水平分別下降了54.1%和42.3%，而在SFN-S組分別上升了119.7%和72.21%，見圖3。

2.3 SFN經(jīng)miR-200c調(diào)控肺癌腫瘤球干性基因的蛋白表達(dá)

蛋白印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，A549腫瘤球培養(yǎng)72 h后Sphere組腫瘤球中β-catenin、Klf4、c-myc等腫瘤干性相關(guān)基因的蛋白表達(dá)水平較Control組（貼壁細(xì)胞）顯著增高，而SFN-S組較Sphere組明顯下降；加入iRNA-200c處理后上述基因蛋白表達(dá)較Sphere組增高，而在聯(lián)合組（iRNA-200c+SFN）中這些基因蛋白表達(dá)水平低于iRNA-200c組，但高于SFN-S組。Sphere組的E-cadherin蛋白表達(dá)水平低于Control組，SFN-S組則明顯高于Sphere組和Control組；與Sphere組相比，iRNA-200c組稍有下降；聯(lián)合組低于SFN-S組，但高于iRNA-200c組，見圖3～4。

圖3 萊菔硫烷對(duì)A549和H460腫瘤球miRNAs轉(zhuǎn)錄的影響Figure 3 Effect of sulforaphane on transcription of miRNAs in A549 and H460 tumor spheres

2.4 SFN對(duì)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT1、DNMT3a、DNMT3b）表達(dá)的影響

圖4 萊菔硫烷與RNA-200c拮抗物(iRNA-200c)對(duì)肺癌腫瘤球干性相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響Figure 4 Effect of sulforaphane and RNA-200c antagonist on expression levels of stemness relative genes in tumor spheres of lung cancer

SFN處理后肺癌細(xì)胞腫瘤球miR-200c轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，提示SFN可能參與miR-200c的調(diào)控。進(jìn)一步檢測SFN處理腫瘤球前后DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明，與Control組比較，Sphere組A549和H460細(xì)胞株腫瘤球DNMT1（P=0.041、0.039）、DNMT3a（P=0.034、0.029）、DNMT3b（P=0.216、0.141）mRNA轉(zhuǎn)錄水平均不同程度增高；而SFN處理后SFN-S組DNMTs有不同程度下降，其中DNMT1（P=0.028、0.031）和DNMT3a（P=0.019、0.030）下降較為明顯。5-Aza-dC組對(duì)比Sphere組下降更為明顯，見表2。同時(shí)，蛋白印跡法檢測A549和H460腫瘤球的結(jié)果提示，與Sphere組比較，SFN-S組的DNMT1（P=0.003、0.007）和DNMT3a（均P=0.000）蛋白表達(dá)水平均顯著下降，見圖5。

圖5 萊菔硫烷處理肺癌細(xì)胞腫瘤球后DNMTs蛋白表達(dá)變化Figure 5 Changes of DNMTs proteins level in tumor spheres of lung cancer cells treated by SFN

表2 萊菔硫烷對(duì)肺癌細(xì)胞DNMTs mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響 ()Table 2 Change of DNMTs mRNA level in lung cancer cells treated by SFN ()

表2 萊菔硫烷對(duì)肺癌細(xì)胞DNMTs mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響 ()Table 2 Change of DNMTs mRNA level in lung cancer cells treated by SFN ()

Notes:#:P<0.05,compared with Sphere group;*:P<0.05,compared with Control group.Adherent cells treated with 1‰ DMSO were taken as negative control.Tumor spheres treated with 5-Aza-dC were taken as the positive control.SFN-S group was treated with 5μmol/L SFN.

2.5 SFN對(duì)miR-200c啟動(dòng)子-GFP質(zhì)粒的影響

將穩(wěn)定表達(dá)miR-200c啟動(dòng)子-GFP質(zhì)粒的A549和H460細(xì)胞株進(jìn)行腫瘤球培養(yǎng)，加入SFN（5.0 μmol/L）終濃度處理上述腫瘤球72 h，熒光顯微鏡下觀察對(duì)照組（質(zhì)粒空載）和SFN-S組熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，盡管SFN對(duì)A549和H460細(xì)胞腫瘤球形成有不同程度的抑制作用，SFN-S組腫瘤球熒光強(qiáng)度高于對(duì)照組。蛋白印跡法分析發(fā)現(xiàn)，SFN-S組GFP蛋白表達(dá)水平高于空載組，見圖6。

圖6 萊菔硫烷對(duì)pEGFP-miR200c質(zhì)粒腫瘤球GFP表達(dá)的影響Figure 6 Effect of sulforaphane on expression of GFP in tumor spheres of lung cancer cells transfected with pEGFP-miR200c plasmid

2.6 SFN下調(diào)miR-200c啟動(dòng)子甲基化水平

結(jié)果表明，上游跨越核苷酸-315至-169 bp（總共9個(gè)CpG位點(diǎn)）存在豐富的甲基化位點(diǎn)。對(duì)照組存在9個(gè)CpG甲基化位點(diǎn)，CpG殘基1和7處的MZF1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)被高度甲基化，甲基化水平為（88.9±3.51）%，而SFN-S組和去甲基化劑5-Aza-dC組MZF1甲基化分別為（44.4±1.53）%和（38.8±2.46）%，SFN-S組或5-Aza-dC組與對(duì)照組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖7。

圖7 SFN處理A549腫瘤球前后miR-200c啟動(dòng)子甲基化水平Figure 7 Methylation level of miR-200c promoter before and after SFN treatment of A549 tumor spheres

3 討論

SFN長期以來被用于抗衰老和預(yù)防腫瘤發(fā)生。近二十年來研究人員發(fā)現(xiàn)萊菔硫烷在治療腫瘤方面也有較強(qiáng)的作用。SFN不僅能有效抑制肺癌細(xì)胞的增殖和其形成腫瘤球的能力，還能特異地通過干性相關(guān)基因抑制肺癌干細(xì)胞的增殖[8]。SFN處理惡性腫瘤細(xì)胞（如非小細(xì)胞肺癌、膠質(zhì)瘤、前列腺癌、鼻咽癌、結(jié)腸癌等）后可調(diào)控β-catenin、Klf4、c-myc、STAT、GSK3β等多種信號(hào)通路蛋白的表達(dá)水平，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并影響腫瘤干細(xì)胞的自我更新[10-12]。Li等[13]發(fā)現(xiàn)，SFN通過miR-124-3p靶向STAT通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖和自我更新。Georgikou等[14]證實(shí)在人胰腺癌組織中高水平的miR-30a-3p和低表達(dá)的縫隙連接蛋白Cx43提示腫瘤惡性程度高；在移植瘤模型中轉(zhuǎn)染miR-30a-3p抑制物的腫瘤細(xì)胞組移植瘤體積減小且對(duì)吉西他濱敏感度增高；SFN顯著抑制miR-30a-3p的轉(zhuǎn)錄水平，促進(jìn)縫隙連接細(xì)胞間通訊，降低胰腺癌細(xì)胞的惡性程度。近年研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中，SFN（10 μmol/L）同樣影響microRNA表達(dá)譜，引起60個(gè)microRNA的上調(diào)和32個(gè)microRNA的下調(diào)；在3個(gè)乳腺癌細(xì)胞株中SFN降低了miR-23b、miR-92b、miR-381和miR-382的表達(dá)水平[15]。本團(tuán)隊(duì)既往研究也發(fā)現(xiàn)SFN處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞SWO-38時(shí)明顯改變多種miRNA（如miR-9、21、221、124、128、181等）的轉(zhuǎn)錄水平[16]。本研究應(yīng)用全基因測序法檢測SFN處理肺癌細(xì)胞腫瘤球時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞miRNA表達(dá)譜發(fā)生明顯改變，數(shù)十種miRNA水平出現(xiàn)上升或下降，miRNA-200c的轉(zhuǎn)錄水平上升最為明顯。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SFN處理后E-cadherin表達(dá)水平升高，β-catenin、Klf4、c-myc等干性相關(guān)基因和DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT1和DNMT3a）表達(dá)水平下降。這些結(jié)果提示SFN可能通過影響多種不同miRNA組合的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控一系列細(xì)胞信號(hào)通路，特別是干細(xì)胞相關(guān)通路，從而有效抑制腫瘤增殖。

對(duì)于SFN對(duì)miRNA轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制少有報(bào)道。Zhou等[17]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SFN可能促進(jìn)Nrf2的去甲基化啟動(dòng)子區(qū)域增加Nrf2的激活，從而誘導(dǎo)結(jié)腸癌的化學(xué)預(yù)防。miR-200c是miR-200家族重要成員，能顯著抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移，提高化療藥物敏感度。馮浪[18]發(fā)現(xiàn)胃癌組織中miR-200c表達(dá)水平較癌旁組織低，相關(guān)性分析證明癌組織miR-200c表達(dá)水平與鉑類化療效果呈正相關(guān)關(guān)系，說明提高胃癌組織miR-200c表達(dá)水平可以提高腫瘤細(xì)胞的化療敏感度?；謴?fù)miR-200c的表達(dá)可增加子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感度，逆轉(zhuǎn)耐藥性的產(chǎn)生[19-21]。Gao等[22]的實(shí)驗(yàn)表明SFN處理人肺癌A549細(xì)胞時(shí)在表觀遺傳水平調(diào)控miR-9-3啟動(dòng)子的CpG位點(diǎn)去甲基化。張媛悅等[23]通過實(shí)驗(yàn)表明肝癌細(xì)胞中miR-200c的過表達(dá)導(dǎo)致4個(gè)啟動(dòng)子甲基化水平顯著降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SFN處理后肺癌細(xì)胞腫瘤球的miRNA-200c轉(zhuǎn)錄水平明顯升高。將miR-200c上游啟動(dòng)子序列作為GFP啟動(dòng)子后，構(gòu)建質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染到肺癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)SFN處理的腫瘤球GFP強(qiáng)度較對(duì)照組增高；對(duì)插入的miR-200c上游啟動(dòng)子序列甲基化水平檢測提示，SFN降低了DNA序列甲基化水平，與去甲基化藥物5-Aza-dC效果類似。結(jié)合SFN處理肺癌細(xì)胞后DNMT1和DNMT3a表達(dá)水平上升的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示SFN可能在表觀遺傳學(xué)水平下調(diào)miR-200c啟動(dòng)子甲基化水平，從而調(diào)控miR-200c的轉(zhuǎn)錄。

總之，本研究證實(shí)，SFN可能經(jīng)表觀遺傳學(xué)水平下調(diào)miR-200c啟動(dòng)子甲基化水平，促進(jìn)miR-200c的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控肺癌干細(xì)胞的干性相關(guān)基因表達(dá)。不排除SFN經(jīng)DNA甲基化水平調(diào)節(jié)，調(diào)控其他miRNA轉(zhuǎn)錄水平。SFN展現(xiàn)出表觀遺傳機(jī)制（包括DNA甲基化和去乙?；龋┱{(diào)節(jié)基因及miRNA水平的強(qiáng)大能力，說明其腫瘤預(yù)防和治療的應(yīng)用潛力巨大，值得深入研究。