piR-9994對胃癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響及其機制

林華妹，鄒長棪，蘇穎，胡丹，廖錦容，林可焴，何火聰，鄭雄偉，林賢東,3

0 引言

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，對人類健康構成重大威脅。中國是胃癌的高發(fā)地區(qū)，發(fā)病率和死亡率持續(xù)上升，并呈顯著的年輕化趨勢[1]。胃癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉移及凋亡等機制仍未闡明[2-3]，亟需深入探索其生物學機制。由于多數(shù)胃癌被發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，失去手術機會，生存率低，預后差，因此尋求新的胃癌標志物及有效的生物治療靶點是進一步改善胃癌預后的關鍵。

piRNA是一類新發(fā)現(xiàn)的非編碼小RNA，長25～31 nt，因與PIWI蛋白結合故命名為piRNA。通過與PIWI蛋白相互作用而發(fā)揮作用，其與保持基因組穩(wěn)定性、調節(jié)表觀遺傳學、生殖干細胞分化、胚胎發(fā)育和多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[4]。近年有關piRNA與腫瘤的相關性已成為研究熱點[5]。前期有實驗通過測序技術篩選到多個胃癌特異性piRNAs,piR-9994便為其中之一[6]；piR-9994在胃癌組織中過表達，并與腫瘤分期和神經(jīng)侵犯密切相關[7]。本實驗檢測piR-9994在胃癌細胞中的表達，通過細胞學實驗明確其對胃癌細胞增殖、周期及侵襲的影響，探討piR-9994與胃癌生物學機制的相關性。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑

人胃癌細胞株MGC803和AGS購自國家實驗細胞資源共享平臺，正常人胃黏膜上皮細胞株GES-1購于中科院上海細胞庫，HyClone DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基（美國GE公司），胎牛血清（FBS,美國Gibco公司），RNeasy Mini Kit（德國Qiagen公司），PCNA、CCND1（CyclinD1）、Bcl-2、c-PARP、N-cadherin、MMP7、Twist、Vimentin、E-cadherin、β-actin、抗兔/鼠HRP標記的IgG抗體（美國Cell Signaling Technology公司）。Transwell小室（美國Millipore公司），MTT細胞增殖檢測試劑MCE Thiazolyl Blue（美國Promega公司）。MiDETECTATrackTMmiRNA qRT-PCR Stater Kit、Pir-has-9994單鏈mimics和Pir-has-9994 inhibitor（廣州市銳博生物科技有限公司）。MUSE cell cycle Kit（美國Millipore公司）。LipofectamineRnaiMax（美國Invitrogen公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)和Pir-has-9994質粒感染

將GES-1、AGS、MGC803細胞分別培養(yǎng)于包含10%FBS、100 u/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基中，放置在37℃和5%CO2的濕度環(huán)境培養(yǎng)箱中，2～3 d傳代一次，所有實驗均采用對數(shù)生長細胞。MGC803細胞以5×105個/孔接種于6孔板中，待每孔細胞培養(yǎng)至單層60%～80%，將3 μl待轉染的質粒（150 μl無血清培養(yǎng)基稀釋）和9 μl Lipofectamine轉染試劑（150 μl無血清培養(yǎng)基稀釋）混勻后逐滴加至每孔，輕搖混勻，培養(yǎng)48 h。通過瞬轉技術利用空載質粒和過表達質粒建立對照的MGC803細胞株（MGC803/NC（過表達））和高表達piR-9994的MGC803細胞株（MGC803/piR-9994-OE），利用空載質粒和干擾質粒建立對照的MGC803細胞株（MGC803/NC（敲低））和低表達piR-9994的MGC803細胞株（MGC803/piR-9994-IN）。

1.3 實驗方法

1.3.1 MTT法檢測細胞增殖能力 將MGC803細胞、MGC803/NC（過表達）細胞和MGC803/piR-9994-OE細胞/MGC803/NC（敲低）細胞和MGC803/piR-9994-IN細胞以5×103個/孔接種到96孔板中，各設3個復孔，共3個96孔板，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，去掉上清液，加入2 mg/ml的MTT液50 μl，置于37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育4 h，每孔加入150 μl的二甲基亞酚，振蕩儀上振蕩混勻，用僅含血清的DMEM/高葡萄糖200 μl培養(yǎng)液作為背景消減，用BIO-RADModel680檢測490 nm的吸光度值。實驗重復三次。

1.3.2 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 收集MGC803細胞、MGC803/NC（過表達）細胞和MGC803/piR-9994-OE細胞/MGC803/NC（敲低）細胞和MGC803/piR-9994-IN細胞以8×105個/孔接種到6孔板中，各設3個復孔，放置在37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細胞單層鋪滿。用無菌的10 μl槍頭沿著直尺在孔正中劃一根從上到下的直線，去掉上清液及漂浮的細胞，用PBS洗滌細胞3次，拍照后，加入5 ml無血清培養(yǎng)基，置于37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，拍照。實驗重復三次。

1.3.3 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 把各組細胞濃度調整為8×105個/毫升，取100 μl接種于Transwell上室，下方用1 mg/ml的基質膠（美國Millipore公司）進行包被，下室用含30%FBS的培養(yǎng)基作為趨化吸引條件，將小室懸掛在24孔板中。置于37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育48 h，上室細胞用棉簽擦除，小室用甲醇固定15 min，用0.1%的結晶紫進行染色。隨機選擇5個視野進行觀察，使用×200倒置顯微鏡下觀察計數(shù)，確定各組細胞的平均數(shù)。實驗重復三次。

1.3.4 細胞集落實驗檢測細胞增殖能力 收集各組細胞以500個/孔接種到6孔板中，各設3個復孔，放置在37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14天，期間根據(jù)培養(yǎng)液pH變化適時更換新鮮培養(yǎng)液，當出現(xiàn)肉眼可見克隆時，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，PBS液小心浸洗兩次，晾干。甲醇固定15 min，棄甲醇后晾干。Giemsa染液染色10 min，用流水緩慢洗去染液，晾干，計數(shù)細胞集落個數(shù)。實驗重復三次。

1.3.5 Western blot檢測蛋白表達 將細胞在冰上裂解，超聲離心后取上清液，BCA法測定蛋白濃度，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法轉印至硝酸纖維素膜上。2%BSA封閉1 h后分別加入1:1 000稀釋的一抗4℃環(huán)境過夜，1×TBST洗滌3次，加入二抗封閉120 min，1×TBST洗滌3次后ECL發(fā)光試劑盒顯色，凝膠成像系統(tǒng)照相，分析灰度值。

1.3.6 實時定量熒光PCR檢測piR-9994含量 檢測GES-1、AGS、MGC803細胞、MGC803/NC（過表達）細胞和MGC803/piR-9994-OE細胞/MGC803/NC（敲低）細胞和MGC803/piR-9994-IN細胞piR-9994含量。收集常規(guī)培養(yǎng)的對數(shù)生長期的細胞，提取細胞總RNA，反轉錄cDNA。利用熒光定量qRT-PCR（miDETECT A TrackTMmiRNA qRTPCR Starter Kit試劑盒）進行檢測，具體步驟簡述如下：取2 μl cDNA進行qPCR擴增，擴增程序為：95℃ 10 min；95℃2 s，60℃ 20 s，70℃10 s，40個循環(huán)；進行熔解曲線檢測。每個樣本重復3次取平均值。以5S為內(nèi)參基因。mRNA的相對定量用2-ΔΔCt法。piR-9994和5S引物購自廣州銳博公司。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。配對資料的比較采用配對t檢驗；兩組間比較先進行正態(tài)性檢驗及方差齊性分析，后進行兩獨立樣本t檢驗。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，兩組之間均數(shù)比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 qRT-PCR檢測胃癌細胞系中piR-9994的表達情況及piR-9994過表達、敲低的MGC803細胞的構建

結果顯示piR-9994在MGC803和AGS細胞中的表達水平高于GES-1（P<0.001），見圖1A。根據(jù)前期預實驗結果，后續(xù)研究選擇MGC803細胞系進行過表達/敲低實驗。piR-9994在MGC803/piR-9994-OE表達水平顯著高于MGC803/NC（過表達）（P<0.001），見圖1B。piR-9994在MGC803/piR-9994-IN表達水平顯著低于MGC803/NC（敲低）（P<0.0001），見圖1C。以上結果表明MGC803/piR-9994-OE和MGC803/piR-9994-IN胃癌細胞株構建成功。

圖1 piR-9994在胃癌細胞系中的表達以及構建piR-9994過表達或敲除MGC803細胞株Figure 1 Expression of piR-9994 in gastric cancer cell lines and construction of MGC803 cell line with piR-9994 overexpression or knockdown

2.2 piR-9994過表達/敲低對胃癌細胞增殖、侵襲及轉移能力的影響

MTT結果顯示，相比對照組MGC803/NC（過表達）,MGC803/piR-9994-OE細胞的增殖能力增強（P<0.01），見圖2A。細胞集落實驗結果顯示，MGC803/piR-9994-OE細胞形成集落數(shù)顯著高于MGC803/NC（過表達）（32.78±2.75vs.70.56±4.92,P=0.0026），見圖2B。細胞劃痕實驗結果顯示，MGC803/piR-9994-OE細胞遷移能力高于MGC803/NC（過表達），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見圖2C～D。Transwell侵襲實驗結果顯示，MGC803/piR-9994-OE細胞遷移個數(shù)增加，明顯高于MGC803/NC（過表達）（122.80±2.28vs.168.60±2.45,P=0.0002），見圖2E。以上結果表明，piR-9994過表達可促進胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移。

圖2 piR-9994過表達對MGC803細胞增殖生長和遷移侵襲的影響Figure 2 Effect of piR-9994 overexpression on proliferation,migration and invasion of MGC803 cells

MTT結果顯示，相比對照組MGC803/NC（敲低），MGC803/piR-9994-IN細胞增殖能力顯著減弱（P<0.05），見圖3A。細胞集落實驗結果顯示，MGC803/piR-9994-IN細胞形成集落數(shù)低于MGC803/NC（敲低）（30.67±3.22vs.13.56±0.40,P=0.0062），見圖3B。細胞劃痕實驗結果顯示，MGC803/piR-9994-IN細胞遷移能力相比于MGC803/NC（敲低）顯著下降（P<0.01），見圖3C～D。Transwell侵襲實驗結果顯示，MGC803/piR-9994-IN細胞穿膜個數(shù)減少，顯著低于MGC803/NC（敲低）（149.1±7.50vs.85.07±2.28,P=0.0012），見圖3E。以上結果表明，piR-9994敲低可抑制胃癌細胞的增殖、侵襲和轉移。

圖3 piR-9994的敲低對MGC803細胞增殖生長和遷移侵襲的影響Figure 3 Effect of piR-9994 knockdown on proliferation,migration and invasion of MGC803 cells

2.3 piR-9994對胃癌細胞周期影響

流式細胞術檢測結果顯示，MGC803/piR-9994-OE組S期細胞百分比明顯高于MGC803/NC（過表達），見圖4A（P<0.05），而MGC803/piR-9994-IN組S期細胞百分比明顯低于MGC803/NC（敲低），見圖4B（P<0.05）。S期為DNA復制期，提示piR-9994表達與細胞周期密切相關，piR-9994異常表達可能導致周期改變。

2.4 piR-9994對細胞增殖相關基因表達的影響

qRT-PCR和Western blot結果顯示，在MGC803/piR-9994-OE中PCNA、CCND1、Bcl-2表達水平顯著高于MGC803/NC（過表達）（P<0.01），c-PARP表達水平低于MGC803/NC（過表達）（P<0.001）。而在MGC803/piR-9994-IN中PCNA、CCND1、Bcl-2表達水平顯著低于MGC803/NC（敲低）（P<0.05），c-PARP表達水平高于MGC803/NC（敲低）（P<0.05），見圖4。PCNA、CCND1、Bcl-2表達與細胞增殖正相關，c-PARP表達與細胞增殖負相關，以上結果提示piR-9994促進MGC803細胞增殖和抑制其凋亡。

圖4 piR-9994表達對MGC803細胞周期和增殖相關基因表達的影響Figure 4 Effect of piR-9994 expression on cell cycle and proliferation-related genes expression of MGC803 cells

2.5 piR-9994對胃癌細胞EMT進展的影響

結果顯示：piR-9994過表達時，N-cadherin、MMP7、Twist和Vimentin高表達，E-cadherin低表達（P<0.05），見圖5A～C；piR-9994敲低時，E-cadherin高表達，N-cadherin、MMP7、Twist和Vimentin低表達（P<0.05），見圖5D～F。以上結果表明，piR-9994過表達增加細胞的運動及侵襲、轉移能力，誘導細胞發(fā)生EMT現(xiàn)象。

圖5 piR-9994表達與MGC803細胞EMT相關基因表達的關系Figure5 Relation between piR-9994 expression and EMT-related genes expression in MGC803 cells

3 討論

piRNA是一種特異性表達的內(nèi)源性小分子RNA，長25～31nt，與PIWI蛋白結合形成piRNA/PIWI復合物，影響轉座子沉默、精子發(fā)生、基因重排、表觀遺傳調控、蛋白質調控和生殖干細胞維持。研究表明piRNA在乳腺癌、食管癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、腎母細胞瘤等多種實體腫瘤中有差異表達[7-10]；食管癌中piR-823通過異常的DNA甲基化產(chǎn)生致癌作用，且與淋巴結的轉移密切相關[8]。非小細胞肺癌中piR-651異常表達與腫瘤進展有關，體內(nèi)體外實驗表明piR-651的過表達促進肺癌細胞的侵襲和轉移[11]。

本項目的前期研究通過測序技術和生物信息學技術構建piRNA在胃癌中的表達譜，同時篩選出50個在胃癌及癌旁組織中有差異性表達的piRNAs，其中17個在胃癌組織中高表達，33個低表達，piR-9994為高表達的piRNA之一[6]；進一步通過大樣本胃癌組織標本分析表明，piR-9994在胃癌組織高表達，piR-9994在胃癌組織中的表達比癌旁組織上調2.3倍（P=0.002），而且與腫瘤分期、神經(jīng)侵犯密切相關（P<0.05）[7]。本實驗在此基礎上，構建piR-9994過表達與敲低的胃癌細胞株MGC803，進行生物學功能研究。研究表明，piR-9994過表達促進胃癌細胞增殖、侵襲、遷移，而piR-9994敲低抑制胃癌細胞增殖、侵襲、遷移。同時piR-9994與細胞周期密切相關。以上結果，從組織學和細胞學層面分析表明，piR-9994參與胃癌發(fā)展進程并發(fā)揮重要作用。

上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition,EMT）是指上皮細胞失去其頂端-基底極性和細胞間黏附特性，轉變成具有侵襲性的間充質細胞的過程。大量研究表明EMT是腫瘤細胞侵襲轉移的重要機制之一，與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關[12]，EMT的激活使胃癌上皮細胞具有間質細胞的特征，上皮極性減少，而且間質細胞獲得干細胞侵襲、轉移、抗凋亡及耐藥等特征。前期研究工作顯示，piR-9994在胃癌組織中異常表達與EMT密切相關[13]。本實驗進一步發(fā)現(xiàn)，piR-9994過表達胃癌細胞組中Twist、N-cadherin、MMP-7、Vimentin高表達，而E-cadherin低表達。piR-9994敲低胃癌細胞組中Twist、N-cadherin、MMP-7、Vimentin低表達，而E-cadherin高表達。以上結果表明，piR-9994異常表達影響EMT進程，但具體機制仍需進一步研究。

綜上所述，piR-9994參與胃癌發(fā)展進程并發(fā)揮重要作用，其異常表達影響胃癌細胞增殖、侵襲、轉移及EMT進程。piR-9994可能是胃癌的新的標志物和治療靶點。