心肌細(xì)胞條件性Ppara敲除小鼠模型中他莫昔芬安全有效劑量的篩選*

王晶晶 池亞菲 喬 欣 盧 靜

(首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069)

條件性基因敲除技術(shù)常用于具有胚胎致死性或具有特定的組織細(xì)胞生理學(xué)與病理生理學(xué)功能的目的基因研究，且基因靶向或轉(zhuǎn)基因小鼠中條件和組織特異性重組系統(tǒng)的出現(xiàn)允許以時(shí)間調(diào)控和細(xì)胞特異性方式評估單個(gè)基因的功能。誘導(dǎo)型條件性基因打靶系統(tǒng)的建立，使得對基因在時(shí)間和空間上的靶位修飾更加明確，且效果也更加精確可靠。該技術(shù)已發(fā)展為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一個(gè)全新且強(qiáng)有力的研究手段。

心肌細(xì)胞特異性表達(dá)ERT2Cre(Myh6-ERT2Cre)小鼠是Jackson Laboratory構(gòu)建的心肌細(xì)胞特異性表達(dá)他莫昔芬(tamoxifen)誘導(dǎo)的Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠，代表了在發(fā)育中和成年心臟內(nèi),任何loxP靶向基因的時(shí)間調(diào)控失活或在心臟中特異性指導(dǎo)loxP失活的心臟轉(zhuǎn)基因重組和表達(dá)的工具鼠[1]。表達(dá)Myh6-ERT2Cre的小鼠心肌細(xì)胞在未給予他莫昔芬處理時(shí)，并不發(fā)揮Cre重組酶的活性，而給予他莫昔芬后，Cre重組酶發(fā)生構(gòu)象改變，并入核與loxP位點(diǎn)特異性結(jié)合而發(fā)揮基因重組的功能。Hall等[2]研究報(bào)道，使用他莫昔芬會造成小鼠短暫性的心臟功能損傷，所以合適且有效的他莫昔芬使用劑量有待探究。

為了得到誘導(dǎo)型心肌細(xì)胞特異性Ppara敲除小鼠，同時(shí)規(guī)避使用他莫昔芬造成心臟功能損傷而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究通過給予Pparafl/fl, Myh6-ERT2Cre小鼠不同劑量的他莫昔芬，驗(yàn)證Ppara基因敲除效率及對心臟功能影響，從而成功構(gòu)建誘導(dǎo)型心肌細(xì)胞特異性Ppara基因敲除小鼠。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物：Myh6-ERT2Cre小鼠經(jīng)由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司代理購自Jackson Laboratory(005657)，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可號：SCXK(京)2016-0006。Pparafl/fl來自于美國Gonzalez教授課題組。實(shí)驗(yàn)所需Pparafl/fl和Pparafl/fl, Myh6-ERT2Cre小鼠飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)SPF級動物房獨(dú)立送回風(fēng)凈化籠(Individual ventilation cage，IVC)內(nèi)，相對濕度：50%～60%，溫度：22～24 ℃，12 h/12 h明暗交替，自主飲食和飲水。所有實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格遵守動物倫理和動物福利的要求，按照美國國立衛(wèi)生研究院制定的《實(shí)驗(yàn)動物管理和使用指南》和首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理委員會的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，倫理委員會審批號：AEEI-2018-127。

1.1.2主要試劑：他莫昔芬(T5648)乙醇油溶液(含20%乙醇的他莫昔芬玉米油溶液)及玉米油(C8267)，購自Sigma；TRIzol(15596018)，購自Invitrogen；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(A5001)，購自Promega；SYBR Green(RR420A)，購自Takara；核蛋白提取試劑盒(78835)，購自Thermo；麗春紅、酸性品紅及苯胺藍(lán)，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents(78835)，購自Thermo；PVDF膜(ISEQ00010)，購自Millipore；脫脂牛奶(P1622)，購自普利萊；PPARα一抗(ab97609)和LAMIN B1一抗(ab133741)，購自Abcam。

1.1.3主要儀器:小動物超聲影像系統(tǒng)(Vevo 2100，Visual Sonics)；實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀和Western blot垂直電泳系統(tǒng)(Bio-Rad)；倒置(熒光)顯微鏡(OLYMPUS)。

1.2 方法

1.2.1小鼠模型的建立:6～7周齡的雄性Pparafl/fl, Myh6-ERT2Cre小鼠，隨機(jī)分為：對照組(腹腔注射含20%乙醇的他莫昔芬玉米油溶液)、A組(單次腹腔注射他莫昔芬2 mg/只)、B組(20 mg/kg，連續(xù)注射他莫昔芬5 d)和C組(40 mg/kg， 連續(xù)注射他莫昔芬5 d)，n=8。注射后繼續(xù)飼養(yǎng)兩周。

1.2.2小鼠心臟超聲監(jiān)測:所有實(shí)驗(yàn)小鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)日使用Vevo 2100TM高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)進(jìn)行心臟超聲，主要檢測心臟橫切面，留取1～2個(gè)清晰穩(wěn)定的影像圖像進(jìn)行后期測量統(tǒng)計(jì)分析，包括反映心臟功能狀態(tài)的左心室射血分?jǐn)?shù)(EF%)、左心室短軸縮短率(FS%)等指標(biāo)。

1.2.3Masson染色:將心臟于4%多聚甲醛中固定24 h后，進(jìn)行常規(guī)組織脫水、石蠟包埋、病理切片及染色。對切片進(jìn)行Masson染色后，封片及觀察。根據(jù)METAVIR評分標(biāo)準(zhǔn)按照F0～F4等級進(jìn)行評分。

1.2.4Real-time qPCR:TRIzol提取組織總RNA，使用Promega GoScript TM反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)將2 μg 總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。 Real-time qPCR使用SYBR Green和Bio-Rad CFX Connect系統(tǒng)進(jìn)行，反應(yīng)程序：95 ℃、 3 min，95 ℃、 45 s，60 ℃、40 s進(jìn)行擴(kuò)增，共40個(gè)循環(huán)。熔解曲線：55～90 ℃，每個(gè)循環(huán)增加0.5 ℃。PCR結(jié)束后，將數(shù)據(jù)導(dǎo)至Excel表，分析結(jié)果：以Actb為內(nèi)參基因，采用公式 2-△△CT計(jì)算PparamRNA的相對表達(dá)量，并進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)學(xué)比較分析。引物序列如下：Ppara5′-CCCTGAACATCGAGTG CGAA-3′，Ppara5′-TTCGCCGAAAGAAGCCCTTA-3′，Actb5′-ATGGAGGGGAATACAGCCC-3′，Actb5′-TTC TTTGCAGCTCCTTCGTT-3′。

1.2.5Western blot:按照Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents試劑盒的使用說明從心臟組織中提取核蛋白，并進(jìn)行蛋白濃度的測定、定量及變性。10% SDS-PAGE凝膠電泳分離50 μg核蛋白，使用Trans-Blot Turbo Transfer System轉(zhuǎn)移至PVDF膜在5%脫脂牛奶中封閉，PPARα一抗和LAMIN B1一抗4 ℃孵育過夜。過夜后，進(jìn)行常規(guī)洗滌及孵育HRP二抗，ECL顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠的交配及基因型鑒定

Pparafl/fl, Myh6-ERT2Cre小鼠來源于Pparafl/fl小鼠和Myh6-ERT2Cre小鼠的雜交后代。將Pparafl/fl小鼠和Myh6-ERT2Cre小鼠進(jìn)行雜交及回交，根據(jù)基因型鑒定結(jié)果獲得Pparafl/fl, Myh6-ERT2Cre小鼠和同窩對照Pparafl/fl小鼠，之后將Pparafl/fl, Myh6-ERT2Cre小鼠和Pparafl/fl小鼠進(jìn)行交配繁殖以滿足實(shí)驗(yàn)所需(見圖1)。

圖1 小鼠的交配及基因型鑒定Fig.1 Mating and genotyping of mice

2.2 小鼠注射他莫昔芬后心臟超聲結(jié)果

Pparafl/fl, Myh6-ERT2Cre小鼠注射他莫昔芬兩周后進(jìn)行心臟超聲監(jiān)測，檢測結(jié)果顯示4組小鼠的室壁厚度(LVST)、心室容積等指標(biāo)未見改變，而對心臟功能指標(biāo)EF%和FS%進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)：與對照組相比， A組及B組小鼠的心功能均未見有所改變，而C組小鼠的心功能有所下降，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此結(jié)果提示C組的注射方式對Pparafl/fl, Myh6-ERT2Cre小鼠的心臟功能產(chǎn)生一定程度的損害(見圖2)。

圖2 小鼠注射他莫昔芬后EF%和FS%值Fig.2 EF% and FS% of mice after administration with tamoxifen

2.3 注射他莫昔芬后心臟組織中Ppara mRNA的表達(dá)水平

Pparafl/fl,Myh6-ERT2Cre小鼠注射他莫昔芬兩周后檢測其心肌組織中PparamRNA的表達(dá)水平。Real-time qPCR結(jié)果顯示：給予Pparafl/fl, Myh6-ERT2Cre小鼠他莫昔芬兩周后心肌組織中PparamRNA的表達(dá)水平均會降低，尤其是B組和C組的小鼠心肌組織中PparamRNA的表達(dá)水平極低，說明劑量為20 mg/kg或40 mg/kg連續(xù)5 d的他莫昔芬注射方法可以達(dá)到誘導(dǎo)性敲除心肌細(xì)胞中Ppara的效果(見圖3)。

圖3 小鼠注射他莫昔芬后心肌組織中Ppara mRNA的表達(dá)注：與對照組相比，*P<0.05，****P<0.0001Fig.3 Expression of Ppara mRNA in myocardium after administration with tamoxifenNote: Compared with the vehicle group, *P<0.05,****P<0.0001

2.4 注射他莫昔芬后非心臟組織中Ppara mRNA的表達(dá)水平

為了明確給予他莫昔芬兩周后是否會影響Pparafl/fl, Myh6-ERT2Cre小鼠除了心肌外的其余組織細(xì)胞中PPARα的正常表達(dá)，提取了血管、肝臟、腎臟、骨骼肌、肺、白色脂肪和棕色脂肪總RNA，Real-time qPCR檢測這些組織中PparamRNA的表達(dá)改變,結(jié)果顯示：給予他莫昔芬不會影響Pparafl/fl, Myh6-ERT2Cre小鼠非心肌組織中PparamRNA的表達(dá)水平(見圖4)。

圖4 小鼠注射他莫昔芬后非心肌組織中Ppara mRNA的表達(dá)改變Fig.4 Expression of Ppara mRNA in non-myocardium after administration with tamoxifen

2.5 注射他莫昔芬后心臟Masson染色結(jié)果

Pparafl/fl, Myh6-ERT2Cre小鼠注射他莫昔芬兩周進(jìn)行心臟組織石蠟切片Masson三色染色，觀察心肌組織纖維化的改變情況。對Masson三色染色結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析顯示：與對照組相比，A組和B組小鼠的心肌組織形態(tài)未見改變，而C組小鼠的心肌纖維化面積增加，此結(jié)果說明高劑量他莫昔芬40 mg/kg注射5 d的給予方式對Pparafl/fl, Myh6-ERT2Cre小鼠的心肌造成了一定程度的損害(見圖5)。

圖5 他莫昔芬注射后心肌組織Masson染色注：與對照組相比，*P<0.05Fig.5 Masson staining of myocardium after administration with tamoxifenNote: Compared with the vehicle group，*P<0.05

綜上所述，連續(xù)5 d腹腔注射20 mg/kg他莫昔芬的給藥劑量可以達(dá)到建立誘導(dǎo)型心肌細(xì)胞特異性Ppara敲除(Ppara△CM)小鼠的效果。

2.6 他莫昔芬誘導(dǎo)型心肌細(xì)胞特異性Ppara敲除小鼠心肌組織中PPARα蛋白表達(dá)水平

為了進(jìn)一步明確Ppara△CM小鼠的成功建立，給予Pparafl/fl, Myh6-ERT2Cre小鼠連續(xù)5 d腹腔注射20 mg/kg他莫昔芬兩周后提取心肌組織中核蛋白，檢測心肌組織中PPARα的表達(dá)改變。Western blot結(jié)果顯示：連續(xù)給予20 mg/kg他莫昔芬5 d，兩周后Pparafl/fl, Myh6-ERT2Cre小鼠心肌組織中PPARα的表達(dá)殆盡，達(dá)到了誘導(dǎo)性敲除心肌細(xì)胞中Ppara的效果(見圖6)。

圖6 Western blot檢測Ppara△CM小鼠心肌組織中PPARα的表達(dá)Fig.6 Expression of PPARα in myocardium of Ppara△CM mice by Western blot

3 討論

傳統(tǒng)的基因敲除小鼠是在DNA同源重組、胚胎干細(xì)胞等技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)行基因打靶制備的，但并不適用于具有胚胎致死性或調(diào)控生理與病理生理關(guān)鍵基因的研究。使用Cre-loxP技術(shù)控制小鼠基因缺失組織特異性的能力具有極為先進(jìn)的小鼠遺傳學(xué)和檢測體內(nèi)單個(gè)基因功能的能力[3]。但是，Cre-loxP方法的一個(gè)重大局限性是無法暫時(shí)控制遺傳重組，而利用組織或細(xì)胞特異性啟動子和藥物誘導(dǎo)劑的Cre重組酶的表達(dá)可對基因重組事件進(jìn)行空間和時(shí)間限制。Myh6-ERT2Cre小鼠就是可以利用他莫昔芬實(shí)現(xiàn)心肌細(xì)胞特異性和時(shí)間調(diào)控的基因重組工具小鼠[1]。

在Myh6-ERT2Cre小鼠中，Cre重組酶與兩個(gè)突變的雌激素受體域融合，當(dāng)與雌激素類似物他莫昔芬結(jié)合后此融合蛋白便從細(xì)胞質(zhì)穿梭到細(xì)胞核中發(fā)揮基因重組的功能[4-5]。Myh6-ERT2Cre小鼠在條件性基因敲除實(shí)驗(yàn)中得到了廣泛的應(yīng)用[6]。然而，Hall等[2]和Lexow等[7]報(bào)道表明，帶有心肌細(xì)胞特異性Cre重組酶給予他莫昔芬后可造成小鼠劑量依賴性的急性心臟功能障礙、心肌死亡、炎癥及纖維化，甚至死亡。Andersson等[8]研究表明，可以利用瞬時(shí)效應(yīng)或減少他莫昔芬的總劑量來最大程度地降低其心臟副作用。因此，本研究根據(jù)Gopal等[9]和Liang等[10]報(bào)道，對所選擇的不同方案從Pparafl/fl, Myh6-ERT2Cre小鼠心臟功能、組織形態(tài)學(xué)及PPARα的誘導(dǎo)性敲除水平進(jìn)行綜合評估，建立有效穩(wěn)定的可誘導(dǎo)型心肌細(xì)胞特異性Ppara敲除小鼠。研究發(fā)現(xiàn)三種他莫昔芬給藥劑量均不會造成心臟收縮功能障礙，但單次給予2 mg/只他莫昔芬腹腔注射組不能充分敲低心肌細(xì)胞中Ppara的表達(dá)。雖然高劑量的40 mg/kg連續(xù)給藥5 d的方案可以達(dá)到心肌細(xì)胞中Ppara的敲除效果，卻造成了一定程度的心功能影響及心肌纖維化增加。因此，20 mg/kg連續(xù)腹腔注射他莫昔芬5 d的給藥方案可以充分敲除心肌細(xì)胞中的Ppara，并且不會造成小鼠心功能和心肌的損傷，成功構(gòu)建的Ppara△CM小鼠，這將為研究成年心臟中PPARα的基因調(diào)控功能提供了基礎(chǔ)。