女金片的HPLC指紋圖譜研究及聚類分析

王 玉，李 佳，陳廣云，王 萍

（淮安市食品藥品檢驗所，江蘇 淮安 223300）

中藥指紋圖譜是一種綜合的，可量化的鑒定手段，建立在中藥成分系統(tǒng)研究的基礎上，可實現(xiàn)對中藥整體物質(zhì)的有效控制。自2010年版開始已載入中國藥典，具有分離效率高、分析速度快、檢測靈敏度高、方法重現(xiàn)性好的特點，可反映待測樣品的特征性和整體性[1-2]。

女金片由鹿角霜、陳皮、當歸、白芷、川芎、延胡索、甘草、牡丹皮、黃芩、阿膠、益母草等23味中藥按照一定的制法制成，是婦科常用中成藥，具有調(diào)經(jīng)養(yǎng)血，順氣化瘀之功效，臨床上用于經(jīng)血不調(diào)、趕前錯后、腰腿酸痛等上述癥狀者[3-4]。目前多是關(guān)于女金片含量測定的報道，但其測定的成分較單一，不足以綜合反映女金片的整體質(zhì)量[5-7]。本試驗采用高效液相法，以芍藥苷為參照峰，在選定的色譜條件下，標定出9個色譜特征峰，建立了12批市售女金片的高效液相指紋圖譜，同時進行了聚類分析，為女金片的質(zhì)量標準建立及其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UltiMate 3000型高效液相色譜儀（DIONEX公司）；Milli-QR型超純水機（美國密理博有限公司）；XS205-DU型電子天平（均為METTLER公司，精度為十萬分之一）；XP-6型電子分析天平（均為METTLER公司，精度為百萬分之一）；KH72000DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

女金片均為市售（樣品S1～S12批號分別為1903201，1804201，2002202，2011201，20200104，20201101，20181001，20191101，20201001，180009，180010，180007）；芍藥苷對照品（批號：110736-201943；含量95.1 %）；橙皮苷對照品（批號：110721-201818；含量96.2 %）；黃芩苷對照品（批號：110715-201821；含量95.4 %），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司）；其他試劑均為分析純； 純化水為自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[8-10]

色譜柱：Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，北京迪科馬科技有限公司）；流動相：乙腈（A相）-0.05 %磷酸溶液（B相）按表1梯度洗脫；檢測波長：230 nm；柱溫：30 ℃；流速：0.8 ml/min；進樣量：10 μl。

表1 梯度洗脫時間程序表

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取芍藥苷對照品2.104 mg、橙皮苷對照品2.041 mg、黃芩苷對照品3.946 mg，置入50 ml量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取女金片細粉約1 g，精密稱定，置入20 ml量瓶，加入稀乙醇15 ml，超聲處理（功率160 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，加稀乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 指紋圖譜方法學考察

2.3.1 參照峰的選擇 在女金片指紋圖譜中，通過與混合對照品圖譜對照（見圖1），指認出4號峰為芍藥苷，4號峰的峰面積適中，分離完全，穩(wěn)定性較好，設為參照峰（S）。以下試驗均以各供試品溶液色譜圖中4號峰的保留時間和峰面積值為參考，計算其他共有峰的相對保留時間和相對峰面積。

圖1 高效液相色譜圖

2.3.2 精密度試驗 取女金片細粉約1 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按擬定色譜條件重復進樣6次，記錄色譜圖，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于0.36 %，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 取女金片細粉6份，各約1 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按擬定色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于0.71 %，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取女金片細粉約1 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別在0，2，4，6，10，16，24 h進樣，按擬定色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于0.31 %，表明女金片供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 指紋圖譜的建立及分析

2.4.1 指紋圖譜的構(gòu)建 取女金片樣品（S1～S12），按“2.2.2”項下方法制備，按“2.1”項色譜條件進行指紋圖譜測定，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件（2012年A版）進行數(shù)據(jù)導入、匹配、校正，建立女金片指紋圖譜共有模式。根據(jù)匹配結(jié)果確定9個共有峰，并生成對照指紋圖譜（R），見圖2。通過與對照指紋圖譜比較，計算各批次樣品的相似度（見表2）；以芍藥苷峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積（見表3、表4）。由表中數(shù)據(jù)可見，S1～S12號樣品圖譜與對照圖譜的相似度均大于0.90，表明12批不同樣品具有良好的相似性。

表2 12批女金片指紋圖譜相似度

表3 12批樣品HPLC圖譜共有峰的相對保留時間

表4 12批樣品HPLC圖譜共有峰的相對峰面積

圖2 12批女金片的指紋圖譜

2.4.2 共有峰的歸屬 取混合對照品溶液和供試品溶液，按擬定色譜條件進樣，得到色譜圖（見圖1）。通過比較樣品和混合對照品指紋圖譜中共有峰的保留時間及紫外吸收光譜對共有峰進行歸屬，確認其中4號峰為芍藥苷，6號峰為橙皮苷，7號峰為黃芩苷。

2.4.3 聚類分析 以3個廠家12批樣品9個共有峰的相對峰面積為變量，采用SPSS 22.0軟件，以組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法及歐氏距離平方為測度對樣品進行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖3。由圖3可見聚類趨勢，當類間距為5時，12批樣品被聚為三大類：S1、S2、S3、S4聚為一類，S5、S6、S7、S8、S9聚為一類，S10、S11、S12聚為一類。每一類均為同一廠家產(chǎn)品，表明同一廠家產(chǎn)品質(zhì)量具有較高的穩(wěn)定性。

圖3 12批樣品聚類分析樹狀圖

3 討論

3.1 檢測波長選擇

中藥復方制劑成分復雜，不同成分在不同波長下有最大吸收。文獻采用230 nm測定女金片中芍藥苷的含量[5]，橙皮苷和黃芩苷的含量時選用280 nm[6-7]。本試驗中采用DAD檢測器在200～800 nm波長對樣品進行了全波長檢測，結(jié)合文獻[11-12]，比較不同波長下的圖譜。結(jié)果表明，230 nm波長處得到的色譜峰數(shù)目較多，信息較為全面，故選擇230 nm作為檢測波長。

3.2 供試品溶液的制備

本試驗對供試品提取溶劑的種類（甲醇、稀乙醇）、提取方法（超聲、回流）和提取時間（15，30，60 min）進行考察。結(jié)果表明，甲醇提取效率低，部分共有峰分離度不符合要求；超聲提取和回流提取的提取率無明顯差異，但超聲操作簡便，用時較短，故選擇稀乙醇超聲作為供試品溶液的制備方法。

3.3 指紋圖譜分析

本試驗建立了女金片的指紋圖譜共識別出9個共有峰，克服了單一化學成分作為質(zhì)控指標的難題，較好地反應了該制劑的內(nèi)在質(zhì)量信息，為女金片的總體研究提供了理論參考依據(jù)。但本制劑藥味眾多，未能確認出每個共有峰的歸屬，因此，需要進一步完善該指紋圖譜中共有峰的確認，為女金片質(zhì)量標準的制定提供更多的數(shù)據(jù)支撐。

3.4 聚類分析

12批女金片的指紋圖譜具有相同的色譜特征峰，但各色譜特征峰峰面積的相對比值有所差異。文獻表明，原料藥材來源及藥材質(zhì)量均會影響色譜峰峰面積，提示各廠家在選擇藥材投料生產(chǎn)前應注意藥材成分含量的檢測。