和力智能低溫高效提取技術提取沙田柚中苦味物質(zhì)含量測定研究

劉常青，蘇雨苗，陳麗宜，宋力飛

（廣州澤力醫(yī)藥科技有限公司，廣東 廣州 510700）

沙田柚Citrus grandis（L.）Osbeck cv. Shatian屬于蕓香科、柑橘屬，是我國柚類的名種之一，原產(chǎn)于廣西容縣沙田村，后廣泛栽培于廣西、廣東、江西、湖南等地。沙田柚果實較大，果皮色澤金黃，形似梨或葫蘆，果肉晶瑩飽滿，帶有清新香氣，汁水少，口感清甜爽脆[1-3]。沙田柚營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、糖、有機酸、果膠、纖維素、維生素C等物質(zhì)，還包含一些天然活性成分，主要有黃酮類，香豆素類，檸檬苦素類，揮發(fā)油等[4-17]。沙田柚及其提取物具有抗癌、抑菌、降血糖、抗氧化、止咳祛痰、降血脂和防止動脈粥樣硬化、抗炎鎮(zhèn)痛等生理功能[18-20]。檸檬苦素和柚皮苷作為柚子中的主要苦味物質(zhì)，是引起柚子苦澀氣味的主要成分之一，具有抗焦慮，抗癌，抑菌，降低膽固醇，抗病毒等生理活性，其抗癌活性已成為研究熱點[21-23]。

沙田柚于民國初年引進廣東梅州，目前梅州已成為中國最大的沙田柚生產(chǎn)基地，2018年柚子及其他柑橘類品種栽培面積60.08萬畝，年產(chǎn)量為94萬噸，其中柚子產(chǎn)量79萬噸[24]。沙田柚產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展同時，品質(zhì)退化、品種良莠不齊、病蟲害日趨嚴重、化學農(nóng)藥大量使用、系統(tǒng)規(guī)范的栽培管理技術缺乏、成熟高效的采后保鮮與深加工工藝缺乏等問題也日益突出[25]。

和力智能低溫高效提取技術（HHLSE）能在室溫下對物料進行提取，很好地保留原藥材的物質(zhì)成分及風味，較好地保持最終產(chǎn)物的原特征[26-27]。HHLSE提取過程包括粉碎、提取、分離、精制、濃縮等相應工序。本試驗用梅州沙田柚作為原材，經(jīng)HHLSE提取柚肉提取液、柚肉膜濃縮液；并建立沙田柚檸檬苦素含量的檢測方法，采用中國藥典[28]“化橘紅”項下方法檢測柚皮苷含量。通過對比沙田柚原材、提取液及膜濃縮液中檸檬苦素、柚皮苷的含量，為該經(jīng)濟作物綜合開發(fā)利用提供依據(jù)，為沙田柚產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

梅州沙田柚，產(chǎn)地為廣東省梅州市五華縣。

1.2 儀器

和力智能低溫高效提取技術及成套設備（廣州澤力醫(yī)藥科技有限公司）；高效液相色譜儀（島津 LC-10AT VP PLUS）；TB-114電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；TU-1900 雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；Diamonsil C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.3 試劑

檸檬苦素對照品（批號：200606，純度≥98 %，北京儀化通標科技有限公司）；柚皮苷對照品（批號：200802，純度≥98 %，北京儀化通標科技有限公司）；甲醇分析純（批號：20201022，天津市富宇精細化工有限公司）；乙腈色譜純（批號：R141915，北京迪科馬科技有限公司）。

2 方法與結果

2.1 檸檬苦素測定方法

2.1.1 色譜條件 Diamonsil C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.02 %磷酸溶液（42:58）；流速：1.1 ml/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μl；檢測波長：205 nm。

2.1.2 溶液的制備

2.1.2.1 檸檬苦素對照品溶液的制備 精密稱取檸檬苦素對照品5 mg置入5 ml量瓶，用甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻即制得1.0 mg/ml對照品儲備液；精密吸取0.5 ml 檸檬苦素對照品儲備液，用甲醇稀釋定容于10 ml量瓶，制成0.05 mg/ml對照品標準液。

2.1.2.2 供試品溶液的制備 將梅州沙田柚去皮、粉碎，取5 g細碎品，用甲醇超聲提取并定容于50 ml量瓶，用0.45 μm濾膜濾過得柚肉原材供試品溶液；取柚肉原材20 kg，分別加純水8倍、6倍進行提取，經(jīng)HHLSE提取[27]后得到柚肉提取液、柚肉膜濃縮液，用0.45 μm濾膜濾過即得柚肉提取物供試品溶液。

2.1.3 測定波長的選擇 取“2.2.1”項下所述對照品標準液，以甲醇作為溶劑空白，用紫外分光光度計在波長200～400 nm掃描，確定檸檬苦素最大吸收波長205 nm。

2.2 柚皮苷測定方法

2.2.1 色譜條件 柚皮苷色譜檢驗條件參考中國藥典[26]“化橘紅”項下方法：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-醋酸-水（35:4:61）為流動相；檢測波長為283 nm。理論板數(shù)按柚皮苷峰計算應不低于1000。

2.2.2 柚皮苷對照品溶液的制備 按照中國藥典[26]“化橘紅”項下的方法進行柚皮苷對照品溶液的制備。取柚皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含60 μg溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 同“2.1.2.2”項。

2.3 柚肉檸檬苦素含量測定方法學考察

2.3.1 線性關系考察 精密吸取“2.2.1”項下的檸檬苦素對照品儲備液，用甲醇分別稀釋配制成0.002，0.005，0.02，0.05，0.1，0.5，1.0 mg/ml質(zhì)量濃度的檸檬苦素對照品溶液，按照“2.1”項色譜條件測定。以測得峰面積為橫坐標（X），相對進樣的濃度為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得檸檬苦素的回歸方程。以S/N=3信噪比計，測定方法的最低檢測濃度。結果：檸檬苦素的回歸方程Y=2.635×10-7X-0.045，r=0.990，檸檬苦素在0.05～1 μg的范圍內(nèi)具有良好的線性關系，方法的最低檢測限為0.5 ng。

2.3.2 精密度試驗 取檸檬苦素對照品標準液，按照“2.1”項色譜條件連續(xù)進樣5次，以測得檸檬苦素的峰面積A為指標，測得平均峰面積A為36543，相對標準偏差RSD為1.39 %，表明該方法精密度良好。

2.3.3 重現(xiàn)性試驗 分別取同一批梅州沙田柚肉提取物，平行取樣5份供試液，按照“2.1”項色譜條件進樣10 μl測定，以測得峰面積A為指標，測得平均峰面積A為113663，計算相對標準偏差RSD為2.59 %，表明該方法的重現(xiàn)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 分別取同一批梅州沙田柚肉提取物，分別于0，2，4，6，8 h按照“2.1”項色譜條件進樣10 μl測定，以測得峰面積A為指標，測得平均峰面積A為46449，計算相對標準偏差RSD為2.33 %，表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收試驗 按照高、中、低3個濃度梯度，精密移取已知含量的柚肉提取物樣品，加入不同量的檸檬苦素標準溶液，按照“2.1”項色譜條件重復測定3次，計算回收率，見表1。由表1可見，檸檬苦素的加樣回收率為99.60 %～100.96 %，RSD為0.50 %～1.83 %。

表1 加樣回收率實驗結果（n=3）

2.4 樣品的測定

取梅州沙田柚原材、提取液及膜濃縮液，按照“2.1”項色譜條件測定檸檬苦素含量，按照“2.2”項下檢測方法測定柚皮苷含量。結果見表2～表3。

表2 沙田柚原材及提取物檸檬苦素的含量分析（n=3）

表3 沙田柚原材及提取物柚皮苷的含量分析（n=3）

3 結論與討論

本試驗采用HHLSE提取梅州沙田柚果肉，得到柚肉提取液和膜濃縮液，采用高效液相色譜法檢測樣品檸檬苦素含量，建立了檢測柚肉檸檬苦素的方法。方法學考察試驗結果表明，此法具有良好的線性關系，精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性及加樣回收率良好，檸檬苦素分離度及峰型較好，可作為檢測柚肉檸檬苦素的方法。

HHLSE提取過程包括粉碎、提取、分離、精制、濃縮等相應工序。試驗結果表明，該提取工藝保留了沙田柚果肉中大部分的檸檬苦素、柚皮苷，提取率較高，同時作為一種低溫瞬提技術，又能較好的保持柚肉原材的風味和營養(yǎng)物質(zhì)，可作為一種低溫、高效的提取柚肉檸檬苦素及柚皮苷的工藝技術。

梅州市作為金柚之鄉(xiāng)，當前的金柚產(chǎn)業(yè)面臨著從“中期控質(zhì)”到“后期功能延伸”的關鍵環(huán)節(jié)[29-30]。目前國內(nèi)外對沙田柚的研究主要集中在栽培管理技術，精深加工方面，精深加工產(chǎn)品主要在涼果領域，特別是以果皮精油和果膠為主，其他活性物質(zhì)如水溶性多糖等也已經(jīng)成為新的研究熱點[31]。藥用方面研究應用與產(chǎn)品則少之又少。本研究結果表明，柚肉中含有豐富的檸檬苦素、柚皮苷，可制成具有理氣化痰功效的飲料，也可作為提取檸檬苦素、柚皮苷原料，這與魏華強[32]等研究結果一致。對梅州沙田柚進行綜合利用研究，不但可提高企業(yè)的經(jīng)濟效益，還利于梅州沙田柚產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的循環(huán)經(jīng)濟之路。