GC-MS測定西洋參中的腐霉利

朱日然，牛水蛟，劉 瑩，張先勤，李啟艷，林鈺鎵＊

（1. 山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南250012；2. 山東省食品藥品檢驗研究院/國家藥品監(jiān)督管理局 化妝品原料質量控制重點實驗室，山東 濟南 250101；3. 濟南市歷下區(qū)衛(wèi)生和計劃生育監(jiān)督所，山東 濟南 250021）

西洋參，五加科人參屬植物西洋參（Panax quinquefolium L.）的干燥根[1]，最初生長于北美洲原始森林中，主產于加拿大和美國，后經引進，在我國遼寧、山東、吉林、北京等地廣泛種植[2]。西洋參性涼、味甘、微苦，補氣養(yǎng)陰性能極佳，在治療陰虛津傷、氣陰兩虛等方面較人參更為柔和，適宜于中老年及身體虛弱人群食用[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，西洋參作為臨床貴重藥材之一，在提高免疫力、抗癌、降血糖等方面有顯著功效[4]。但作為一種外來名貴藥材，西洋參同樣面臨多種病害的威脅，如西洋參1～2年生上立枯病、拌倒病的發(fā)病率較大，在3～4年生上黑斑病、白粉病的發(fā)病率較大[5]。莊緒靜等[6]采用腐霉利對西洋參病害進行防治，得到了較好的效果。

腐霉利（速克靈、二甲菌核利），國際通用名：Procymidone，化學名稱：N-（3,5-二氯苯胺）-1,2-二甲基環(huán)丙烷-1,2-二羰基亞胺，結構見圖1，是一類環(huán)酰亞胺類農用內吸性殺菌劑，于1972年由日本住友化學株式會社研制成功。主要通過抑制菌體內甘油三酯合成，達到保護和治療農作物病害的雙重作用[7]。

圖1 腐霉利結構式

然而作為一種有機氯農藥，腐霉利對人體和土壤環(huán)境均有一定危害，因此，歐盟和美國等國家或地區(qū)，相繼對進口食品中的腐霉利殘留量提出了嚴格的限量標準，如歐盟規(guī)定果蔬中腐霉利的最大殘留限量（maximum residue limit，MRL）值為0.02 mg/kg，美國食品和藥物管理局（FDA）和加拿大規(guī)定葡萄酒中腐霉利的MRL值分別為0.2 mg/kg和1.0 mg/kg，日本實行的“肯定列表制度”中有關食品限量的暫定標準規(guī)定腐霉利的MRL值為0.02 mg/kg，而對于其他在暫定標準以外的農業(yè)品實行“一律標準”，即0.01 mg/kg[8]，我國也制定了蔬菜和油脂等產品中腐霉利殘留的限量標準[9]。

目前腐霉利殘留的檢測方法主要有氣相色譜法[10]、熒光光譜法[11]、高效液相色譜法[12]、氣相色譜-串聯(lián)質譜法[13]等。前處理方法主要有固相萃取法[14]、基質固相分散萃取[15]、QuEChERS法[16]等。QuEChERS法是一種較新穎的前處理方法，具有分析速度快，溶劑使用量少，簡便、快速、靈敏、準確等優(yōu)勢，可簡化繁雜的凈化步驟。氣相色譜-串聯(lián)質譜法（GC-MS）具有定性、定量準確，靈敏度高，線性范圍廣等優(yōu)點。本研究采用乙腈提取，QuEChERS凈化，外標法定量，GC-MS法測定西洋參中腐霉利的殘留量，以期建立一種快速檢測西洋參中腐霉利殘留量的分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Thermo TRACE 1300-ISQ氣相色譜質譜聯(lián)用儀（賽默飛公司）；Mettler Toledo MS 電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；Milli-Q超純水機（Millipore有限公司）； Universal320R高速冷凍離心機（德國Hettich公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

QuEChERS萃取鹽包（4 g MgSO4+1 g NaCl+1 g檸檬酸鈉+0.5 g檸檬酸氫二鈉）；QuEChERS凈化管15 ml（400 mg PSA+400 mg C18+1200 mg MgSO4）。

腐霉利對照品，純度99.8 %，批號B0003652，Be Pure公司；甲苯、乙酸乙酯、乙腈等有機溶劑均為分析純；QuEChERS快速凈化小柱。

1.2 儀器條件

色譜柱：DB-5MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm；載氣：氦氣，純度≥ 99.999 %；恒流流速：1.00 ml/min；進樣方式：不分流；離子源：EI源，離子源溫度：230 ℃；電離能量：70 eV；色質接口溫度：250 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；進樣量：1 μl，溶劑延遲：8 min。

升溫程序：100 ℃保持1 min，以15 ℃/min速率升溫至280 ℃，然后保持15 min，運行總時間28 min。

測定方式：全掃描和選擇離子監(jiān)測同時采集模式。全掃描離子（m/z）：50-300；監(jiān)測離子（m/z）：96，254，283，285；定量離子：m/z 285。

1.3 樣品溶液的制備

稱取西洋參粉末（過三號篩）2.0 g置入50 ml具塞離心管中，先加入水10 ml渦旋混勻，再加入乙腈10 ml和QuEChERS萃取鹽包，用力振搖1 min，4000 r/min離心5 min。先用2 ml甲苯預飽和凈化管，混勻凈化管，取6 ml乙腈層加入凈化管中，渦旋混勻后4000 r/min離心3 min，然后取上清4 ml 40 ℃氮氣吹干，加丙酮1 ml復溶后，過0.22 μm有機濾膜，濾液待測定。

1.4 標準溶液的制備

吸取一定量腐霉利對照品（in acetone）置入10 ml量瓶，用丙酮逐級稀釋并定容得到0.5，1.0，2.5，5.0，10 μg/ml的腐霉利系列標準工作溶液，上機測定。

1.5 色譜及質譜行為

在上述儀器條件下，分別對標準溶液和樣品進行測定，得其保留時間為14.59 min，豐度比m/z 96: 254: 283: 285 = 100: 3: 37: 23，見圖2、圖3。

圖2 標準溶液的總離子流圖及選擇離子流圖

圖3 樣品溶液的總離子流圖及選擇離子流圖

2 結果與分析

2.1 方法學驗證

2.1.1 線性范圍、檢出限和定量限 測定“1.4”項中的標準溶液，以面積對濃度作圖，濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。同時，將標準溶液進行稀釋并測定，以S/N=3時的濃度計算檢出限，以S/N=10時的濃度計算定量限，結果見表1。

表1 腐霉利保留時間、線性范圍、回歸方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限

2.1.2 回收率 按“1.2”項方法對空白樣品進行低、中、高3個水平的加標回收試驗，每水平各測定6份，分別計算回收率及相對標準偏差（RSD），結果見表2。

表2 回收率試驗結果（n=6）

2.1.3 穩(wěn)定性 取濃度為5 μg/ml標準溶液對腐霉利進行穩(wěn)定性測試，按上述儀器條件分別在0，2，4，8，12，24 h進行測定，根據(jù)測定的目標化合物峰面積計算RSD為1.99 %，表明該成分在24 h內穩(wěn)定。

2.1.4 日內和日間精密度 取濃度為5 μg/ml標準溶液對腐霉利進行精密度研究，于一日內連續(xù)進樣6次，計算峰面積日內精密度RSD為0.86 %；連續(xù)進樣3天，每天6次，計算3天的峰面積日間精密度RSD為1.66 %，表明日內及日間精密度結果均良好。

2.1.5 重復性 取一批樣品，精密稱定6份，按“1.3”項法制備，按上述儀器條件分別進行測定，根據(jù)測定的目標化合物濃度計算RSD，結果為2.09 %，表明該方法重復性良好。

2.2 樣品測定

本研究共收集不同產地的西洋參藥材35批，采用上述方法對該35批樣品進行前處理并測定，每批樣品平行測定2份，結果表明，共有10批藥材檢出腐霉利，濃度為1.06～3.73 mg/kg。

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇

QuEChERS法有多種提取溶劑，常用的有乙腈、乙酸乙酯、丙酮等，三者對有機化合物提取效果略有不同。本實驗選用乙腈作為提取溶劑，主要有以下3個原因：（1）丙酮與水的互溶度較大，可能導致待測組分的回收率降低；（2） 提取弱極性的化合物時可選用乙酸乙酯，而對于較強極性的成分，乙酸乙酯提取效果不佳；（3）腐霉利結構中含有2個內酰胺鍵，極性較大，適合用乙腈提取，且乙腈對脂肪和色素的溶解性相較丙酮和乙酸乙酯最低，故選擇乙腈作為提取溶劑。

3.2 前處理方法的選擇

QuEChERS法是一種新穎的樣品前處理技術，最初主要用于蔬菜水果樣品中的農藥殘留分析，隨著研究的深入，QuEChERS法已擴展應用到諸多領域。相對于傳統(tǒng)的前處理方法，QuEChERS法是向提取液中加入硫酸鎂等干燥劑和碳18等雜質吸附劑，簡化了樣品的前處理步驟，提高了前處理工作效率，降低了實驗中各因素誤差。

常用鹽析試劑組合是醋酸鈉和檸檬酸鈉兩種體系，本研究選擇了含有4 g MgSO4、1 g NaCl、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉的緩沖鹽體系，其中無水硫酸鎂用于除去基質中的水分，其余的緩沖鹽用于提供適宜的pH用于保證一些對酸堿敏感的農藥可以有好的回收率。

常用的吸附劑有PSA/C18/GCB等，其中C18和GCB主要清除脂類和色素等非極性物質，PSA通過極性、陰離子交換作用力吸附除去極性較強的雜質，如糖類、脂肪酸、有機酸、多酚等。由于西洋參藥材成分復雜，在前處理時有效地除去非目標物質，可防止假陽性的產生，本研究選擇PSA 400 mg + C18400 mg作為吸附劑。

綜上所述，本實驗采用乙腈作為提取溶劑，經QuEChERS 方法提取、凈化西洋參中的腐霉利，選取 PSA 400 mg + C18400 mg作為吸附劑，對西洋參中殘留腐霉利進行GC-MS分析。結果表明，GC-MS法測定西洋參中的腐霉利快速簡便，重復性和靈敏度均較好，在對市場中西洋參的腐霉利殘留量進行檢測的同時，也可為中藥西洋參市場監(jiān)督提供一定的技術支持。