多種中藥協(xié)同對膽管癌細(xì)胞QBC-939增殖的影響

任元靜，強(qiáng)家旭，陳 卉，宋 巍

(1.長江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025； 2.河南城建學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，河南 平頂山 467036)

膽管癌屬于一種消化道的惡性腫瘤疾病，包括肝內(nèi)膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)和肝外膽管癌(extrahepatic cholangiocarcinoma，ECC)。由于其特殊的位置易于侵犯肝門部的肝組織、血管、神經(jīng)及淋巴組織，以至于根治性手術(shù)難度相當(dāng)大，手術(shù)切除率低，愈后較差。不幸的是，膽管癌的總體發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢，這嚴(yán)重威脅人類健康[1-2]。相關(guān)研究報道，大多數(shù)膽管癌患者是在癌癥晚期診斷出的，接受切除和移植并不能改善治療效果，但仍是獲得長期生存率和治愈的唯一可能性手段[3]。對于晚期無法手術(shù)的患者可以通過藥物輔助性治療來達(dá)到手術(shù)治療的最低要求。針對一條通路或單一靶點的藥物在治療初期療效常常很好，但隨后往往由于腫瘤細(xì)胞通過其他的通路逃避藥物治療，而導(dǎo)致療效顯著下降。多靶點藥物和組合治療策略目前已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱門領(lǐng)域[4]。多數(shù)化療藥物對于晚期癌癥患者的治療所獲得的生存率不佳，而且化療常常使人體產(chǎn)生耐藥性和副作用，故尋找出高敏感、低毒副作用的膽管癌治療藥物是十分必要的。本文通過對多種傳統(tǒng)中草藥進(jìn)行篩選以及對其聯(lián)合作用進(jìn)行評價，從而為抗膽管癌的聯(lián)合用藥方案和治療提供新的思路。

1 方法

1.1 藥物與試劑

RPMI-1640、胎牛血清購自Gibco公司；MTT購自生工生物工程股份有限公司；胰酶和青-鏈霉素溶液購自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；大血屯、升麻、蘇木、枟香、黃連、土槿皮、連翹、黃柏等多種藥用植物根莖葉購自張仲景大藥房。

1.2 中草藥提取

利用分體式全自動微電腦陶瓷壺將200 g中藥和2 L純凈水混合液熬至150 mL的藥液。接著將藥液用冷凍干燥機(jī)干燥脫水研碎。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理

人膽管癌細(xì)胞QBC-939為本實驗室保存。QBC-939接種于含有10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，隨后放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將提取粉末溶于超純水配制成100 mg/mL母液，過濾除菌后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細(xì)胞增殖檢測

將QBC-939細(xì)胞以104個/孔接種于96孔板；待細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長期時，使用含有不同濃度的藥物培養(yǎng)液代替初始培養(yǎng)液繼續(xù)放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；接著向每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)孵育4 h；最后，棄去上述培養(yǎng)液加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)混勻后于490 nm處檢測吸光值(OD值)。兩兩聯(lián)合藥物培養(yǎng)液濃度比例為11(聯(lián)合藥物終濃度為25、50、100、200、300、400 μg/mL)。每個藥物試驗至少重復(fù)三次。

1.5 中值效應(yīng)分析

通過以相應(yīng)藥物的IC50為基礎(chǔ)，增加聯(lián)合使用的藥物總劑量，通過MTT試驗測定細(xì)胞的存活率。根據(jù)Chou-Talalay中效原理，由Compusyn軟件計算藥物聯(lián)合指數(shù)CI(combination index)[5-6]以及劑量減少指數(shù)DRI(drug reduction index)。DRI是衡量相同的藥物作用水平下，協(xié)同使用相比單獨使用每種藥物時，劑量減少倍數(shù)的指數(shù)。DRI值越大意味著相同治療效果下，聯(lián)合相比于單味藥減少的越多，但不一定是協(xié)同作用。

2 結(jié)果

2.1 多種單藥對QBC-939細(xì)胞的抑制作用

聯(lián)合指數(shù)計算須基于聯(lián)合藥物各濃度的抑制率，故通過設(shè)置較長濃度區(qū)間，初步確定8種單藥在不同濃度下的抑制效果并由此確定各種單藥的IC50值。分別使用不同濃度(5、25、50、100、200、400 μg/mL)的單藥處理膽管癌QBC-939細(xì)胞24 h，之后檢測細(xì)胞存活率，得到各種中藥分別對膽管癌細(xì)胞QBC-939的半數(shù)抑制濃度IC50值，如圖1所示。其中，蘇木(IC50= 91.63±23.27 μg/mL)、升麻(IC50= 91.5±31.76 μg/mL)、大血屯(IC50= 61.73±58.70 μg/mL)對膽管癌細(xì)胞增殖的抑制作用較好，即較低的IC50值。其他單中藥IC50值如表1所示。

圖1 8種中藥的IC50值

表1 8種中藥對QBC-939細(xì)胞的抑制作用

2.2 聯(lián)合中藥的協(xié)同作用

由8種中藥兩兩組合，共28種組合。通過MTT法從28種組合中篩選出對膽管癌細(xì)胞QBC-939有顯著抑制作用的6種組合：黃連-蘇木、黃連-黃柏、蘇木-黃柏、連翹-升麻、枟香-連翹和枟香-升麻。6種中藥組合的濃度-抑制率成梯度關(guān)系(見圖2(a)、圖2(b))。其中黃連-蘇木、黃連-黃柏、蘇木-黃柏、連翹-升麻、枟香-連翹5種組合呈協(xié)同作用，枟香-升麻呈拮抗作用，如圖3、圖4、圖5和表2所示。同時，通過比較每種中藥組合在相同抑制率水平時，聯(lián)合使用兩種藥物的濃度與該兩種藥物單獨使用的濃度，可得到藥物的濃度減少倍數(shù)，即DRI劑量減少指數(shù)，見表3。

(a) (b)

由表2、表3和圖3可知：黃連-黃柏組合在25%抑制率時，聯(lián)合黃柏使用的黃連濃度相比單獨使用的黃連濃度減少2.258 3倍，即DRI=3.029 3；同時，聯(lián)合使用的黃柏濃度減少3.029 3倍，并且黃柏濃度隨著抑制率增加而顯著減少；當(dāng)抑制率達(dá)到90%時，黃柏濃度減少1 154.08倍。由于聯(lián)合用藥濃度相比單獨用藥濃度顯著減少，所以黃連-黃柏組合表現(xiàn)強(qiáng)協(xié)同作用(CI<0.5)。當(dāng)蘇木-黃柏組合在高抑制率區(qū)間時，聯(lián)合使用的蘇木與黃柏的濃度相比較兩種藥物單獨使用的濃度顯著減少，在75%～90%抑制率區(qū)間時，蘇木濃度減少2.301 9～3.819倍；黃柏濃度減少457.023～4 935.35倍，因此黃連-蘇木組合表現(xiàn)強(qiáng)協(xié)同作用(CI<0.5)。

圖3 黃連-黃柏、蘇木-黃柏藥物組合的聯(lián)合曲線

由表2、表3和圖4可以發(fā)現(xiàn)：當(dāng)黃連-蘇木組合在高抑制率區(qū)間，聯(lián)合使用的黃連與蘇木的濃度相比較藥物單獨使用的濃度顯著減少，當(dāng)75%～90%抑制率時，黃連濃度減少7.845 6～10.013 8倍；蘇木濃度減少2.824 1～4.042 1倍，因此黃連-蘇木組合表現(xiàn)強(qiáng)協(xié)同作用(CI<0.5)。同時，枟香-連翹組合僅在0%～25%低抑制率區(qū)間，表現(xiàn)出強(qiáng)協(xié)同作用(CI<0.5)，聯(lián)合使用的枟香與連翹的濃度相比較單獨使用的濃度減少。但在75%～90%高濃度區(qū)間，枟香-連翹組合表現(xiàn)拮抗作用(CI>1)。

圖4 枟香-連翹、黃連-蘇木藥物組合的聯(lián)合曲線

由表2、表3和圖5可知：枟香-升麻組合在不同抑制率時，聯(lián)合使用的枟香與升麻的濃度相比較單獨使用的濃度都沒有顯著降低。因此，枟香與升麻呈拮抗作用(CI>1)。另一方面，連翹-升麻組合僅在75%～90%高抑制率區(qū)間表現(xiàn)出協(xié)同作用(CI<1)，聯(lián)合使用的連翹與升麻濃度相比較單獨使用的濃度分別減少5.622～5.062 9倍和1.324 5～3.068 6倍。

圖5 枟香-升麻、連翹-升麻藥物組合的聯(lián)合曲線

表2 藥物組合在不同抑制率中的聯(lián)合指數(shù)CI

表3 藥物組合在不同組合中的劑量減少指數(shù)DRI

3 討論

傳統(tǒng)中草藥以天然藥物治療疾病在我國有著悠久的歷史，其活性更多地依賴于多種成分的組合，而不僅僅是其中單一的某種成分。許多中草藥可以通過靶向腫瘤發(fā)生過程中的多個步驟，能夠抑制腫瘤的發(fā)展，它既具有阻滯劑，抑制腫瘤起始發(fā)生的作用，又具有抑制腫瘤發(fā)展過程中惡性細(xì)胞增殖的作用[7-9]。中藥聯(lián)合化療藥物還可以降低化療藥物帶來的副作用，提高治療效果[10-12]。滕文靜等，在溫陽散寒中藥抗肺癌的研究中，基于溫陽扶正抗癌的理論，通過收集文獻(xiàn)報道以溫陽法治療惡性腫瘤最有效的五味中藥進(jìn)行體內(nèi)Lewis小鼠皮下移植瘤的抑瘤作用實驗，發(fā)現(xiàn)中藥中的生物堿類成分蓽茇明堿具有明顯地抑瘤作用[13]。因此，通過實驗研究試圖從中國傳統(tǒng)的中草藥中尋找具有抗腫瘤的藥物。通過體外實驗比較人膽管癌QBC-939細(xì)胞對31種中草藥的敏感性，從中篩選得到大血屯、升麻、蘇木、枟香、黃連、土槿皮、連翹、黃柏8種具有抑制膽管癌細(xì)胞增殖效果的藥物。

中藥復(fù)方在抗腫瘤方面的研究是近年來的熱點，單一藥物成分有時容易使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性、抵抗性，從而表現(xiàn)出較低的抑制效果。左金丸是一個典型的中藥復(fù)方，由黃連和吳茱萸以61比例組成。黃連中的主要成分有逆轉(zhuǎn)MDR的效果，吳茱萸可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。左金丸在體內(nèi)外實驗中均可逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性結(jié)直腸癌。左金丸可以增加結(jié)腸癌 HCT116/L-OHP細(xì)胞、胃癌SGC7901/DDP細(xì)胞和肝癌 Bel/Fu MDR細(xì)胞對化療藥物的敏感性[14]。表明中藥與化療藥物的聯(lián)合使用在抗腫瘤增殖方面具有潛能。本研究通過檢測由8種中藥組成的28種中藥組合對膽管癌細(xì)胞QBC-939的增殖抑制作用發(fā)現(xiàn)：黃連-蘇木，黃連-黃柏，蘇木-黃柏，枟香-連翹和連翹-升麻5種藥物組合在抑制膽管癌增殖過程中具有協(xié)同效應(yīng)。表明聯(lián)合中藥相對于單藥使用具有更好的抗腫瘤增殖效果，中藥組合具有體外抗膽管癌細(xì)胞QBC-939的作用，能夠為膽管癌的臨床治療提供一定理論基礎(chǔ)。