Nrf2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)分析

梁瑞韻 呂志強(qiáng)

肺癌是呼吸系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，隨著全球環(huán)境的進(jìn)一步惡化，肺癌的發(fā)病率及致死率仍然居高不下［1］。非小細(xì)胞肺癌（non-small-cell lung carcinoma，NSCLC）是肺癌的最主要組織學(xué)類型，約占85%-90%［2］。

無論是正常細(xì)胞還是腫瘤細(xì)胞都趨于維持還原穩(wěn)態(tài)以保證自身的生長及增殖，而核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）在這種穩(wěn)態(tài)的維持中起關(guān)鍵作用［3］，Nrf2 在調(diào)節(jié)氧化還原穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞增殖、自噬和DNA 修復(fù)方面均起到一定的作用。Nrf2 是屬于Cap‘n’Collar 家族的轉(zhuǎn)錄因子，具有含有亮氨酸拉鏈（basic region-leucine zip-per）區(qū)域［3］，在包括致癌物和香煙煙油等多種有害環(huán)境下的多器官保護(hù)（肺臟、肝臟、腎臟、胃、小腸、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等）中起關(guān)鍵作用［4］，Nrf2 介導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)反應(yīng)無細(xì)胞特異性和器官特異性。當(dāng)某一器官受到損傷時(shí)，器官內(nèi)的干細(xì)胞即被激活生成新細(xì)胞促使器官組織再生。然而在機(jī)體內(nèi)這種干細(xì)胞活性卻受到了嚴(yán)格地調(diào)控，因?yàn)檫^度的干細(xì)胞活性也可能導(dǎo)致疾病如惡性腫瘤的發(fā)生。Nrf2 具有抑制干細(xì)胞分裂的作用［5］。有研究顯示Nrf2 的表達(dá)在卵巢癌中發(fā)揮重要作用，高表達(dá)的NRF2 能夠進(jìn)癌細(xì)胞增殖［6］，但對(duì)于非小細(xì)胞肺癌中Nrf2 的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系仍有待研究。

為了進(jìn)一步揭示Nrf2 在促進(jìn)NSCLC 發(fā)生發(fā)展中的作用，本文采用免疫組織化學(xué)檢測108 例NSCLC 組織中Nrf2 蛋白表達(dá)情況，探討Nrf2 與患者吸煙、腫瘤的大小、癌的組織學(xué)類型、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的關(guān)系。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取我院胸外科2014 年4 月-2018 年12 月手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的非小細(xì)胞肺癌108 例，且手術(shù)前均未進(jìn)行放療或化療。男67例，女41 例；年齡29-79 歲（中位年齡63 歲）；43 例有嚴(yán)重吸煙史（煙齡年數(shù)×支/天≥200，其中男39例、女4 例）；鱗癌39 例，腺癌69 例（包括細(xì)支氣管肺泡細(xì)胞癌7 例）；高分化33 例，中分化29 例，低分化46 例；53 例伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；根據(jù)WHO（2015）進(jìn)行臨床分期：Ⅰ期38 例，Ⅱ期48 例，Ⅲ期22 例。查閱病歷內(nèi)手術(shù)記錄描述的腫瘤最大徑為腫瘤大小的數(shù)值。所有標(biāo)本均用10%福爾馬林固定，石蠟包埋切片，厚4 μm。

1.2 方法 免疫組化Nrf2（H300）多克隆抗體為Santa Cruz 公司產(chǎn)品，Ki67（SP6）為DAKO 公司，稀釋度均為1∶100（稀釋劑為正常血清）。用微波爐進(jìn)行抗原修復(fù)。一抗4℃孵育過夜。第2 天取出置室溫30 min 后，用PBS 漂洗3×5 min，滴加生化素標(biāo)記的第二抗體，37℃孵育30 min，PBS 漂洗3×5 min。滴加鏈霉素卵蛋白生物素復(fù)合物，37℃孵育45 min，PBS 漂洗3×5 min，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色3-10 min。自來水漂洗，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，中性樹膠封片。以PBS 代替一抗作陰性對(duì)照，以已知陽性的舌癌組織切片作陽性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷 蛋白陽性染色為棕（黃）色，Nrf2表達(dá)于細(xì)胞漿，（圖1）。由2 位病理科醫(yī)生在不了解患者臨床預(yù)后情況下獨(dú)立計(jì)數(shù)4 個(gè)不同高倍視野下200 個(gè)癌細(xì)胞，Nrf2 陽性細(xì)胞數(shù)≥5%為陽性，<5%為陰性。對(duì)獨(dú)立判斷不一致的病例再共同進(jìn)行觀察。

圖1 肺癌免疫組織化學(xué)染色。Nrf2 呈陽性表達(dá)于癌細(xì)胞胞核。SP×200

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 比較采用t檢驗(yàn)，率的比較采用秩和檢驗(yàn)（Kruskal Wallis 和Wilcoxon W），P<0.05為差異有顯著性，使用統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS19.0 在微機(jī)上進(jìn)行。

2 結(jié) 果

在108例NSCLC 組織切片中，81例可見癌旁支氣管纖毛柱狀上皮和肺泡上皮，僅見5 例表達(dá)Nrf2蛋白，陽性率為6.2%。108例NSCLC中有33例Nrf2蛋白呈陽性，陽性率為30.5%，明顯高于癌旁支氣管纖毛柱狀上皮和肺泡上皮（Z=-4.163，P=0.000）。

在67 例男性中，陽性26 例，陽性率為38.8%；41 例女性中，陽性7 例，陽性率為17.1%，兩組比較，前者明顯高于后者（Z=-2.368，P=0.018）。43例的重度吸煙組Nrf2 的陽性率為44.2%（19/43），明顯高于輕吸煙或無吸煙組的21.5%（14/65）（Z=-2.490，P=0.013）。在33 例Nrf2 陽性的NSCLCs 組織中，鱗癌17 例（43.6%），腺癌16 例（23.2%），鱗癌的陽性率明顯高于腺癌（Z=2.200，P=0.028），雖然淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性率（34%，18/53）高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的27.3%（15/55），但兩組比較差異并無顯著性（Z=-0.751，P=0.453）。Nrf2 的陽性率均與腫瘤的大小、組織分化程度、臨床分期等無關(guān)（P>0.05）。見表1。

表1 108 例NSCLC 中Nrf2 蛋白的表達(dá)

3 討 論

Nrf2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2）是一種與腫瘤生長有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子［7］。本組研究中的81 例癌旁支氣管纖毛柱狀上皮和肺泡上皮僅見5 例表達(dá)Nrf2 蛋白，說明這些上皮組織中Nrf2信號(hào)通路的缺失，導(dǎo)致該通路不能介導(dǎo)的抗氧化和抗炎作用，可能是NSCLC 發(fā)生的原因之一。

Nrf2 與吸煙的關(guān)系，在不同的腫瘤文獻(xiàn)有不同的報(bào)道。食管癌組織中NRF2 的表達(dá)與吸煙無關(guān)［8］。在肺癌中，Shibata 等［9］發(fā)現(xiàn)Nrf2 更常表達(dá)于吸煙患者，Hu等［10］也認(rèn)為吸煙在觸發(fā)肺癌發(fā)生的過程中起著重要作用。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在有嚴(yán)重吸煙史患者中的Nrf2陽性率明顯高于輕度吸煙或不吸煙者。本組實(shí)驗(yàn)?zāi)行越M的陽性率為38.8%，明顯高于女性組的17.1%，這可能是重度吸煙者以男性為主的緣故（本組67例男性患者中有39例為重度吸煙者，而41例女性患者中僅有7例）。本組實(shí)驗(yàn)有嚴(yán)重吸煙史患者中Nrf2陽性率明顯高于輕度吸煙或不吸煙者的結(jié)果，提示吸煙誘導(dǎo)了Nrf2的表達(dá)，Nrf2最先可能是存在于胞漿、其保護(hù)作用的，隨著腫瘤化學(xué)誘導(dǎo)劑的出現(xiàn)而從胞漿中釋放并轉(zhuǎn)入細(xì)胞核。在與組織學(xué)類型的關(guān)系方面，鱗癌的Nrf2陽性率明顯高于腺癌，這可能也與吸煙有關(guān)，因鱗癌與吸煙的關(guān)系比腺癌與吸煙的關(guān)系密切，且本組資料中鱗癌組患者的吸煙率也明顯高于腺癌組（39例鱗癌有20例為重度吸煙者，而69例腺癌中只有23例）。

上述結(jié)果提示Nrf2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)具有明顯的差異，但此研究未分析Nrf2的表達(dá)與患者生存預(yù)后的關(guān)系，可有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)以證實(shí)Nrf2的表達(dá)可以在一定程度上提示肺癌患者的遠(yuǎn)期臨床預(yù)后。