流式熒光免疫法檢測原發(fā)性膽汁性膽管炎自身抗體的價值與臨床應用

王 戰(zhàn)， 王 麟， 姚 遠， 劉 靜， 孫桂榮， 劉明軍

青島大學附屬醫(yī)院 檢驗科， 山東 青島 266003

原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis, PBC)是一種慢性的、膽汁淤積性的自身免疫性肝病[1-2]?；颊咴诩膊≡缙谕鶝]有明顯的臨床癥狀，診斷主要依靠血清膽汁淤積相關指標以及自身抗體的檢測，由于出血和感染的風險，肝活檢目前并不是PBC的常規(guī)診斷方法[3-4]。自身抗體作為一種相對無創(chuàng)的檢測方法，具有較高的敏感度和特異度，在PBC的早期診斷中具有重要意義[5-6]?？咕€粒體抗體(antimitochondrial antibody，AMA)是PBC的特征性自身抗體。AMA包括9種亞型，其中AMA-M2亞型是診斷PBC最有意義的自身抗體[7]。除AMA-M2外，約1/3的PBC患者血清中可檢測到核膜型或核點型的抗核抗體，如抗核孔膜蛋白抗體(gp210抗體)或抗核體蛋白抗體(sp100抗體)[3,8-9]。2017年歐洲肝病學會指南指出gp210抗體與sp100抗體對診斷AMA陰性的PBC患者具有較好的輔助作用[10]。因gp210抗體與sp100抗體對PBC的診斷特異度較高，可作為一種可靠的血清標志物，減少肝活檢的必要性[5]。

目前，我國檢測PBC相關自身抗體的主要方法為間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence,IIF)與免疫印跡法(immunoblotting test,IBT)。上述兩種方法均為定性檢測，具有耗時長，操作繁瑣的缺點，其結果依賴于操作者的臨床經(jīng)驗及技術水平，具有較高的主觀性[11]。隨著實驗室檢測技術的不斷發(fā)展，多重微球流式熒光免疫技術(multiplex bead-based flow fluorescent immunoassay，MBFFI)，作為一種新型的自身抗體檢測技術，以熒光編碼微球為核心，能夠實現(xiàn)自身抗體的高通量、快速和定量檢測[12]，對疾病的診斷與病情評估具有重要意義。本研究將MBFFI定量檢測AMA-M2、gp210、sp100 3種自身抗體的結果與IBT進行比較，進一步評估其對PBC的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018年8月—2020年6月于本院就診并臨床確診的PBC患者340例(PBC組)，同時選取自身免疫性肝炎(AIH)患者81例與系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者62例作為其他疾病組。健康對照組選自于本院的健康體檢者117例。PBC診斷依據(jù)2017年歐洲肝病學會臨床實踐指南[4]相關標準：(1)成年膽汁淤積的患者血清ALP水平升高，AMA滴度>1∶40；(2)AMA陰性患者血清中可檢測到特異性抗核抗體(核點型或核膜型)；(3)除非患者缺乏PBC特異性自身抗體或合并AIH、非酒精性脂肪性肝病和其他全身性疾病，否則不建議用肝活檢進行診斷。AIH診斷標準參照2019 年美國肝病學會實踐指引和指南[13]：AIH 的診斷需要符合本病特點的肝組織學檢查結果支持，并符合以下特征，(1)血清轉氨酶水平升高；(2)血清IgG水平升高和/或一種或多種自身抗體陽性；(3)排除其他可導致慢性肝炎的病因，病毒性、遺傳性、代謝性、膽汁淤積性，以及藥物可能誘發(fā)類似AIH的疾病。SLE診斷依據(jù)2012系統(tǒng)性狼瘡國際協(xié)作組的分類標準[14]，臨床標準包括：急性皮膚性紅斑狼瘡、慢性皮膚性紅斑狼瘡、口腔潰瘍、非瘢痕性脫發(fā)、滑膜炎或關節(jié)觸痛和晨僵、腎臟受累、神經(jīng)系統(tǒng)受累、溶血性貧血、白細胞或淋巴細胞減少、血小板減少；免疫學標準包括: 抗核抗體陽性，抗dsDNA抗體陽性、抗Sm抗體陽性、抗磷脂抗體陽性、低補體、直接Coombs實驗陽性。符合4 項標準(至少符合 1 項臨床標準和 1 項免疫學標準)可診斷為SLE。采取受試者空腹靜脈血，低速離心后取上層血清，分兩份于-36 ℃冰箱冷凍保存，檢測前復融至室溫。

1.2 研究方法

1.2.1 IBT檢測 IBT檢測試劑及EUROBlotMaster Ⅱ免疫印跡儀由歐蒙醫(yī)學診斷公司生產(chǎn)，用于體外定性檢測自身免疫性肝病IgG類抗體。本研究中膜條包被的抗原主要包括AMA-M2、gp210、sp100。檢測方法：將膜條放入溫浴槽中，按照1∶100加入稀釋的樣本血清，將膜條置于搖床上溫浴30 min后洗滌；洗滌結束加入酶結合物溫浴30 min，待充分反應后用已稀釋的清洗緩沖液清洗膜條3次，5 min/次；最后加入1.5 mL底物液顯色，待風干后應用EUROBLineScan 軟件判讀結果。所有操作均按照操作標準規(guī)程進行。

1.2.2 MBFFI檢測 MBFFI檢測的試劑及Luminex 200TM多功能流式點陣儀由上海透景生命科技有限公司提供。MBFFI檢測方法：將待檢血清于室溫下復融，加載于TESMI F3999全自動加樣儀上進行樣本處理，應用Luminex 200TM流式點陣儀進行樣本檢測和數(shù)據(jù)處理[15]。本研究中3種自身抗體(AMA-M2、gp210、sp100)的cut off值為20 AU。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。兩種方法對同一種自身抗體檢測結果的一致性應用Kappa檢驗,Kappa≥0.75表明兩種方法檢測的一致性較好，0.40≤Kappa<0.75 表明兩種方法檢測一致性一般，Kappa<0.40表明兩種方法檢測一致性較差。陽性率的比較采用χ2檢驗。受試者工作特征曲線(ROC曲線)應用Graphpad prism軟件進行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MBFFI與IBT檢驗一致性比較 應用MBFFI與IBT對所有樣本血清中的AMA-M2、gp210與sp100抗體進行檢測，每種抗體的檢測陽性率與一致性見表1。兩種方法檢測的每種抗體的陽性率差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)，一致率均>90.00%。計算兩種方法檢測的Kappa指數(shù)，本研究總體樣本中兩種方法檢測一致性最好的抗體為AMA-M2(Kappa=0.895)。

2.2 MBFFI與IBT對PBC組患者血清自身抗體檢測結果比較 應用MBFFI與IBT檢測PBC組340例患者血清肝病相關自身抗體，其陽性率與一致性見表2。兩種方法進行抗體檢測的陽性率差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。兩種檢測方法檢測AMA-M2抗體的一致性最好(Kappa=0.874)；兩種檢測方法檢測gp210與sp100抗體的一致性較好(Kappa值分別為0.713、0.749)。

2.3 MBFFI對AMA-M2、gp210、sp100 3種抗體聯(lián)合檢測的診斷價值 以340例PBC患者為病例組，以其他疾病組與健康體檢者為對照組，應用MBFFI聯(lián)合檢測血清AMA-M2、gp210、sp100 3種抗體，該方法用于診斷PBC的敏感度、特異度等指標見表3。MBFFI對3種自身抗體單項檢測時，AMA-M2抗體的敏感度(72.06%)最高。聯(lián)合檢測gp210與sp100兩種抗體的敏感度高于該兩種抗體的單項檢測，聯(lián)合檢測AMA-M2、gp210與sp100 3種抗體的敏感度高于3種抗體的單項檢測，而特異度小于單項檢測。與單項檢測AMA-M2抗體相比，3種抗體聯(lián)合檢測診斷PBC的誤診率略高但漏診率降低。MBFFI單獨及聯(lián)合檢測3種抗體的ROC曲線見圖1。3種抗體單項檢測時，AMA-M2抗體診斷PBC的ROC曲線下面積(0.850 3)高于gp210抗體(0.703 9)與sp100抗體(0.635 2)。3種抗體聯(lián)合檢測診斷PBC的ROC曲線下面積最大為0.907 0，gp210與sp100抗體聯(lián)合檢測的ROC曲線下面積高于gp210與sp100抗體的單項檢測，但低于AMA-M2抗體的單項檢測及3種抗體的聯(lián)合檢測。

表1 MBFFI與IBT檢測所有樣本總體一致性比較

表2 MBFFI與IBT對PBC組患者血清自身抗體檢測結果比較

圖1 MBFFI檢測AMA-M2、gp210、sp100 3種抗體的ROC曲線

3 討論

自身抗體的檢測對于PBC的早期診斷具有非常重要的意義。AMA是PBC的標志性抗體，而gp210抗體與sp100抗體可出現(xiàn)在30%～50%的AMA陰性的PBC患者中。當患者血清中未檢測出AMA，但具有PBC相關生化及臨床表現(xiàn)時，可以通過檢測gp210與sp100抗體來協(xié)助診斷PBC[16]。IIF是檢測肝病相關自身抗體最廣泛應用的方法，但其缺點在于結果判讀易受人為因素影響[17]。隨后出現(xiàn)的酶聯(lián)免疫吸附試驗、IBT等檢測方法雖然克服了IIF的一些局限性，但仍然具有耗時長、操作繁瑣、無法實現(xiàn)自動化等缺點[18]。隨著實驗室診斷技術的發(fā)展，MBFFI將不同顏色的熒光素按照不同比例與聚苯乙烯微球結合，構建100種帶有可識別熒光的熒光微球。將100種熒光微球與抗原耦聯(lián)，可對多種不同抗原抗體結合物進行檢測，具有靈活性與多抗體性[17]。

本研究中應用MBFFI對所有血清樣本中的AMA-M2、gp210、sp100抗體進行檢測，其陽性率與IBT檢測相差不大，一致性較好。在340例PBC患者中，MBFFI對AMA-M2、gp210與sp100抗體檢測的陽性率與IBT大致相同，一致性較好。IBT為目前檢測肝病相關自身抗體較為成熟且應用廣泛的檢測技術，本研究中MBFFI檢測PBC特異性自身抗體與IBT一致性較好，且具有快速、自動化、高通量和定量檢測等優(yōu)勢，因此MBFFI有可能成為臨床常用的PBC相關自身抗體檢測方法。相關研究表明應用MBFFI聯(lián)合檢測多種自身抗體可能提高診斷某些自身免疫性疾病的敏感度[12]，且其檢測抗核抗體結果與IBT具有較好的一致性[15]，但尚未發(fā)現(xiàn)其他相關研究對MBFFI與IBT檢測PBC相關自身抗體結果的對比評價。

表3 MBFFI檢測AMA-M2、gp210與sp100抗體的診斷性能

本研究與Villalta等[19]應用INOVA診斷公司的一種基于微球的多重分析系統(tǒng)檢測結果相比，應用該方法檢測的AMA-M2、gp210與sp100抗體的敏感度分別為63.90%、23.70%、15.50%，均低于本研究所用的MBFFI方法，但其特異度較高，ROC曲線比較顯示該研究檢測3種自身抗體的ROC曲線下面積為AMA-M2 0.836、gp210 0.528、sp100 0.487。本研究的ROC曲線顯示，AMA-M2、gp210與sp100抗體的ROC曲線下面積分別為0.850 3、0.703 9、0.635 2，均高于Villalta等的研究，檢測結果的差異可能與地域和種族不同有關。此外，本研究發(fā)現(xiàn)AMA-M2、gp210與sp100 3種自身抗體聯(lián)合檢測診斷PBC的ROC曲線下面積更大，提示3種自身抗體聯(lián)合檢測對PBC具有更大的診斷價值，有利于與其他自身免疫性肝病相鑒別。相關研究針對亞洲PBC患者血清gp210與sp100抗體檢測敏感度與特異度進行了分析，與亞洲人群檢測上述兩種抗體的平均敏感度與特異度相比[20]，MBFFI檢測gp210抗體的敏感度較低而特異度高，檢測sp100抗體的敏感度與特異度與平均水平一致。AMA-M2抗體與其他抗體相比在診斷PBC時具有較高的敏感度與特異度，本研究中當3種抗體聯(lián)合檢測時診斷PBC的敏感度要高于AMA-M2抗體的單項檢測，且其漏診率更低，提示3種抗體聯(lián)合檢測更有利于PBC患者的篩查與早期診斷。

綜上所述，MBFFI對于AMA-M2、gp210與sp100 3種自身抗體的檢測與IBT相比一致性較好。應用MBFFI聯(lián)合檢測3種自身抗體對診斷PBC的敏感度更高、診斷價值更大，有利于PBC的早期診斷。本研究還需要進行大樣本和多中心的研究驗證。MBFFI從方法學的角度優(yōu)于IBT，能夠快速、高通量的對樣本進行定量檢測，易于自動化與標準化，符合臨床需求，具有重要的臨床價值。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：王戰(zhàn)負責標本收集，實驗檢測，收集資料，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，文章撰寫；姚遠、孫桂榮參與資料整理和分析；王麟、劉靜參與收集資料和數(shù)據(jù)統(tǒng)計；劉明軍負責課題設計，擬定寫作思路，指導文章撰寫。