基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究小柴胡湯治療乙型肝炎的作用機(jī)制

藍(lán)紹航， 唐秋媛,， 李娜娜， 陶 然， 廖南盛， 蒙蔭杰， 何 草， 毛德文,

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院， 南寧 530001； 2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肝病科， 南寧 530023

乙型肝炎是由HBV引起，以肝臟損害為主要臨床表現(xiàn)的一組全身傳染性疾病[1]。據(jù)統(tǒng)計[2]，我國每年約有30萬人死于乙型肝炎相關(guān)性疾病。目前，西醫(yī)在臨床中治療乙型肝炎多使用恩替卡韋、富馬酸替諾福韋等藥物[3]，雖可延緩病情，但有耐藥風(fēng)險，遠(yuǎn)期預(yù)后不佳[4]。中醫(yī)藥治療乙型肝炎經(jīng)驗豐富，安全性高。其中出自張仲景《傷寒論》中的名方小柴胡湯具有疏肝利膽、和解少陽的功效，臨床中常用其治療肝郁脾虛證乙型肝炎?，F(xiàn)代藥理學(xué)也表明，小柴胡具有顯著的抗肝損害、抗炎、抗癌及免疫調(diào)節(jié)等多種作用[5]。

目前學(xué)界內(nèi)對于小柴胡湯治療乙型肝炎有不少研究，但尚未對其作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)闡釋。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)、藥理學(xué)和藥物化學(xué)的一門綜合性新興學(xué)科，打破了傳統(tǒng)的“一個藥物，一個靶標(biāo)，一種疾病”的思維模式及框架[6]，與中醫(yī)治療疾病的整體觀念和辨證論治原則相符[7]，是中藥發(fā)展與研究的新模式[8]。同時，分子對接可揭示藥物治療疾病的分子機(jī)制，將藥理作用上升到分子水平，為藥物機(jī)制研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)[9]。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對接技術(shù)，深入闡述小柴胡湯多成分、多靶點、多生物學(xué)過程、多通路的協(xié)同治療乙型肝炎的作用機(jī)制，為進(jìn)一步的實驗研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 藥物有效成分篩選及靶點預(yù)測 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)篩選小柴胡湯(柴胡、黃芩、人參、半夏、生姜、大棗、甘草)的全部化學(xué)成分，并以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性指數(shù)(DL)≥0.18為篩選條件，確定藥物的活性成分；在Related Targets一欄中找出其所對應(yīng)的作用靶點，將所有藥物靶點進(jìn)行合并整理，剔除重復(fù)靶點；在Uniport數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)中輸入靶點名稱獲取其對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)基因名。

1.2 乙型肝炎疾病靶點獲取 以“hepatitis B、hepatitis B virus”為檢索詞，限制檢索條件為“gene”“homo sapiens”，在GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/)數(shù)據(jù)庫中獲取乙型肝炎相關(guān)靶點基因。將篩選條件定為Relevance score≥10.0，對收集的所有乙型肝炎靶點進(jìn)行處理，將所有靶點基因進(jìn)行合并，刪除重復(fù)靶點。

1.3 小柴胡湯與乙型肝炎交集靶點篩選 將上述獲得的藥物靶點交集與疾病靶點基因交集通過R語言繪制Venny圖，得到藥物與疾病交集靶點(Drug-Disease)。

1.4 構(gòu)建活性成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò) 將上述所得的小柴胡湯所有藥物的活性成分和乙型肝炎靶點基因交集數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，并對其參數(shù)進(jìn)行設(shè)置，得到活性成分-核心靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)及核心基因預(yù)測 將篩選得到的“Drug-Disease”中的靶點蛋白導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/),限定研究物種為“Homo sapiens”，最低相互作用評分設(shè)置為“0.900”，同時設(shè)置隱藏游離點，其余參數(shù)保持默認(rèn)，進(jìn)行蛋白質(zhì)互作分析，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖。將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，利用CytoNCA插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析篩選關(guān)鍵基因。

1.6 GO功能富集分析與KEGG通路分析 將篩選得到的“Drug-Disease”中的靶點蛋白通過R語言進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路分析，兩者均以P<0.05為篩選指標(biāo)(P<0.01被認(rèn)定是富集顯著，P值越小富集越顯著)。

1.7 分子對接 將1.1節(jié)和1.5節(jié)中整理出degree排名靠前的活性成分與核心靶點進(jìn)行分子對接。在Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中下載活性成分的小分子配體2D結(jié)構(gòu)，再利用ChemBio3D Ultra 14.0軟件生成3D結(jié)構(gòu)，使用優(yōu)化模塊進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化，獲取最穩(wěn)定的分子構(gòu)象，并保存為mol2格式。從PDB(https://www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫下載靶點蛋白受體三維結(jié)構(gòu)，文件保存為PDB格式并導(dǎo)入PyMOL軟件，輸入命令刪除靶蛋白的水分子和小分子配體，完成蛋白受體準(zhǔn)備。將蛋白受體文件導(dǎo)入AutoDock Tools-1.5.6軟件中，對蛋白分子加氫及對非完整氨基酸等問題進(jìn)行矯正，保存文件為pdbqt格式，再將小分子配體文件mol2格式導(dǎo)入AutoDock Tools-1.5.6軟件中，把文件轉(zhuǎn)換為pdbqt格式，最后使用Autodock vina軟件進(jìn)行對接并利用PyMOL軟件進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 小柴胡湯有效活性成分篩選及靶點預(yù)測 經(jīng)TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索，檢索到小柴胡湯7味藥材的有效活性成分共有214個，其中柴胡17個、黃芩36個、人參22個、半夏13個、生姜5個、大棗29個、甘草92個，去重后共獲得193個有效活性成分(表1)。將篩選到的193個有效活性成分基于TCMSP搜索并整理后共得到247個作用靶點。

2.2 藥物靶點與疾病靶點交集 經(jīng)分析得到藥物潛在活性成分靶點247個，乙型肝炎疾病基因1655個，二者得出的交集靶點基因為142個(圖1)。

圖1 藥物靶點和疾病靶點Venny圖

2.3 活性成分-核心靶點相互作用網(wǎng)絡(luò) 將2.2節(jié)得到的142個交集靶點運用Perl相關(guān)腳本進(jìn)行文件處理，所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件進(jìn)行可視化網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，得到活性成分-核心靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(附錄1)。

表1 小柴胡湯部分活性成分信息

附錄1中四周圓形節(jié)點代表藥物的有效成分，橙、黃、綠、深紅、粉紅、灰、黑色分別代表小柴胡湯中的半夏、柴胡、大棗、甘草、黃芪、人參、生姜的有效成分，多個顏色代表多個藥物共同的有效成分，灰色線條代表邊，中間淺藍(lán)色矩形節(jié)點代表中藥和疾病的交集靶點。圖中共有280個節(jié)點，其中來源于化合物的有138個，來源于基因的有142個；經(jīng)統(tǒng)計degree較高的有效成分為槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、漢黃芩素(wogonin)、柚皮素(naringenin)等(表2)。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)及核心基因預(yù)測 將2.2節(jié)的142個交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)定物種為“Homo sapiens”，得出string_interactions文件，并以tsv格式保存。網(wǎng)絡(luò)圖共有142個節(jié)點、622條邊，平均每個節(jié)點的度值為9.32，平均局部聚類系數(shù)為0.507，PPI enrichment p-value值為<1.0e-16，鄰接節(jié)點數(shù)目越多，說明這些蛋白在網(wǎng)絡(luò)中的作用越顯著(附錄2)。

將tsv格式文件數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件中，使用CytoNCA插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治龊Y選關(guān)鍵基因，處于核心位置的靶點有RELA、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)1、TP53、ESR1、EGFR、AKT1、JUN、MAPK8、RB1、STAT3、MAPK3、MYC、MAPK14、CCND1等，提示這些基因在PPI中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，可能是小柴胡湯治療乙型肝炎的核心靶標(biāo)基因(附錄3)。

2.5 GO富集分析和KEGG通路分析 共得到GO富集條目2612條，GO富集條形圖主要展示生物過程(BP，共2375個)、細(xì)胞組分(CC，共60個)、分子功能(MF，共177個)前10條富集結(jié)果(圖2)。KEGG通路分析得到174條富集結(jié)果，并繪制KEGG氣泡圖展示富集通路結(jié)果(僅對P值排序后取前30名進(jìn)行展示，P值越小表明富集越顯著，圖3)。在對KEGG結(jié)果進(jìn)行預(yù)讀后發(fā)現(xiàn)，與小柴胡湯治療乙型肝炎密切相關(guān)的通路有乙型肝炎通路、PI3K-AKT信號通路等。

圖2 交集基因GO條形圖

圖3 交集基因KEGG點圖

2.6 潛在活性成分-核心靶點分子對接分析 根據(jù)小柴胡湯“活性成分-核心靶點”網(wǎng)絡(luò)中靶點與成分連接的度值，選取活性化合物中degree排名靠前的主要活性成分槲皮素、山奈酚、漢黃芩素、柚皮素，分別與經(jīng)拓?fù)浞治龊Y選后的關(guān)鍵核心靶點MAPK1、RELA、TP53、ESR1進(jìn)行分子對接。一般認(rèn)為配體和受體結(jié)合能越低結(jié)合力越好，結(jié)合能≤0 kcal/mol說明兩者可以自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol說明有較好的結(jié)合力，結(jié)合能≤-7.0 kcal/mol說明結(jié)合構(gòu)型具有強(qiáng)烈的活性[10-11]。結(jié)果表明以上主要活性成分與關(guān)鍵靶點的結(jié)合能均≤-7.0 kcal/mol，展現(xiàn)出良好的結(jié)合力(表3，圖4)。

表2 小柴胡湯度值前10位化學(xué)成分基本信息

表3 關(guān)鍵化合物與核心靶點分子對接

注：a，槲皮素-MAPK1；b，山奈酚-RELA；c，黃芩素-TP53；d，柚皮素-ESR1。

3 討論

小柴胡湯為仲景名方，原方主治少陽病，具有良好的疏肝利膽之效，在臨床中防治慢性肝病方面發(fā)揮了重要作用[12-13]。近年來運用小柴胡湯治療乙型肝炎的臨床研究[14-16]使用頻繁。但目前針對小柴胡湯治療乙型肝炎的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子層面的研究尚有欠缺。

為深入研究小柴胡湯治療乙型肝炎的作用機(jī)制，本文應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，共篩選得到193個活性成分及247個作用靶點，通過構(gòu)建活性成分-核心靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)可知槲皮素、山奈酚、漢黃芩素、柚皮素等化合物度值較大，對應(yīng)多個靶點，是小柴胡湯治療乙型肝炎的主要活性成分。其中槲皮素具有良好的抗炎、抗氧化、抗病毒及抗肝纖維化等作用。研究[17-18]發(fā)現(xiàn)，槲皮素能顯著降低HBsAg和HBeAg水平，并可抑制人肝癌細(xì)胞株HBV抗原分泌和基因組復(fù)制，具有顯著的抗HBV活性，接近拉米夫定(69%)。乙型肝炎是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的主因之一，肝纖維化可進(jìn)一步發(fā)展成肝硬化，并最終導(dǎo)致危害人類生命、不可逆轉(zhuǎn)的肝細(xì)胞癌及肝功能衰竭[19]。槲皮素可通過其抗氧化活性和對NF-κB等信號通路的調(diào)節(jié)來抑制肝毒性化合物四氯化碳誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，減弱肝星狀細(xì)胞的活化并減少自噬，從而達(dá)到減少肝臟損傷和預(yù)防肝纖維化的目的[20]。由此可見，度值最高(degree：100)且來自小柴胡湯中多味中藥(柴胡、甘草、大棗)的活性成分槲皮素在小柴胡湯發(fā)揮治療乙型肝炎的作用機(jī)制過程中起著舉足輕重的作用。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，富含在柴胡和甘草中的山奈酚[21-23]、黃芩中的漢黃芩素[24-26]、甘草中的柚皮素[27-28]均已被證實具有抗HBV、抗炎、抗肝纖維化、護(hù)肝抗癌等作用，與本研究所得主要活性成分作用于乙型肝炎的結(jié)果一致。上述主要活性成分均為黃酮類化合物，它們除了具有抗炎、抗病毒等作用，在治療乙型肝炎的過程中還發(fā)揮了抗肝纖維化、護(hù)肝抗癌等多種功效，這與中醫(yī)強(qiáng)調(diào)的“未病先防”“既病防變”等理念不謀而合。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊蠛Y選得到RELA、MAPK1、TP53、ESR1等14個靶點，提示其可能是小柴胡湯治療乙型肝炎的核心靶標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)在HBV X蛋白(HBx)和HBV介導(dǎo)的肝癌發(fā)生的動物模型中，HBx可通過原癌基因RELA與活性DNA脫甲基作用誘導(dǎo)EpCAM表達(dá)，由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞分泌的HBx和TNFα激活的RELA在慢性乙型肝炎及其相關(guān)肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[29]。有研究[30-31]指出在HBV相關(guān)肝癌中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)腫瘤蛋白p53(TP53)突變，證實HBV感染與肝癌中TP53基因之間表達(dá)狀態(tài)相關(guān)的候選單核苷酸多態(tài)性和分子途徑具有密切關(guān)系。HBV是一種性激素應(yīng)答病毒[32]，核受體超家族成員雌激素受體ESR1基因多態(tài)性與HBV持續(xù)感染顯著相關(guān)[33]。研究[34]表明，ESR1可以通過調(diào)節(jié)雌激素穩(wěn)定在一定的水平來阻止肝纖維化，避免肝細(xì)胞炎癥損傷，抑制肝細(xì)胞凋亡等。小柴胡湯可以作用于雌孕激素受體，充分發(fā)揮對肝臟的保護(hù)作用。MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK14等屬于MAPK家族,它們均參與細(xì)胞增長、分化、凋亡、免疫及炎癥反應(yīng)等重要生物過程，并在MAPK信號通路中起著舉足輕重的作用，已知乙型肝炎及其相關(guān)肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展與MAPK信號通路關(guān)系密切[35]。此外，這些靶點均對應(yīng)多個活性成分,如ESR1對應(yīng)柚皮素、芒柄花素等89個活性成分，MAPK14對應(yīng)漢黃芩素、異鼠李素等51個活性成分，這說明小柴胡湯具有多成分、多靶點協(xié)同治療肝炎的作用。

GO功能富集分析結(jié)果表明，小柴胡湯中的活性成分可能通過囊腔、膜筏等細(xì)胞組分參與氧化應(yīng)激反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)等生物學(xué)過程。這些結(jié)果提示小柴胡湯作用于多細(xì)胞組分產(chǎn)生不同生物學(xué)功能，從而發(fā)揮治療乙型肝炎的作用。KEGG通路分析結(jié)果顯示，小柴胡湯作用于乙型肝炎的靶點主要涉及乙型肝炎通路、PI3K-AKT信號通路等。其中乙型肝炎通路是本研究預(yù)測小柴胡湯治療乙型肝炎的靶點中富集最多的通路之一，且該通路直接作用于乙型肝炎，在抗HBV感染及抗炎過程中發(fā)揮重要作用，進(jìn)一步提示了本研究的準(zhǔn)確性和可靠性。PI3K-AKT信號通路與細(xì)胞增殖、周期和凋亡有著密切聯(lián)系[36-37]。研究[38]發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的病毒都會對PI3K-AKT信號通路進(jìn)行調(diào)控，以調(diào)節(jié)病毒在感染早期的活力，實現(xiàn)對宿主細(xì)胞的感染及介導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化等。在HBV引起的慢性感染性疾病中，HBx可通過激活PI3K-AKT信號通路磷酸化轉(zhuǎn)錄因子Bad，抑制caspase 3的活性，進(jìn)而阻斷TGFβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[39-40]。此外，PI3K-AKT信號通路的活化同時也是肝細(xì)胞癌變的主因之一[41-42]。

根據(jù)圖4中的分子對接結(jié)果顯示，槲皮素與MAPK1上的殘基氨基酸LYS-114、ASP-111、GLU-109、MET-108形成氫鍵作用，山奈酚與RELA上的殘基氨基酸GLU-359、GLU-197形成氫鍵作用，漢芩黃素與TP53上的殘基氨基酸THR-97形成氫鍵作用，柚皮素與ESR1上的殘基氨基酸ARG-394、ALA-350、HIS-524形成氫鍵作用。以上主要活性成分與關(guān)鍵靶點經(jīng)過分子對接后提示結(jié)合能均≤-7.0 kcal/mol，匹配能量較低，說明小分子與大分子結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定，結(jié)合性好，展現(xiàn)出良好的結(jié)合力，進(jìn)一步驗證其可信度，對后續(xù)臨床及實驗研究方向具有重要參考價值。

綜上所述，小柴胡湯可能通過槲皮素、山奈酚、漢黃芩素、柚皮素等主要活性成分作用于MAPK1、RELA、TP53、ESR1等關(guān)鍵靶點，通過囊腔、膜筏等細(xì)胞組分參與氧化應(yīng)激反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)等多種生物學(xué)過程，激活或抑制乙型肝炎、PI3K-AKT等主要信號通路，產(chǎn)生抗病毒、抑制炎癥、調(diào)節(jié)免疫、抗肝纖維化、護(hù)肝抗癌等功效，從而發(fā)揮治療乙型肝炎的作用。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對接的方法，闡釋了小柴胡湯治療乙型肝炎的主要有效成分、作用靶點、相關(guān)通路及協(xié)同作用的分子機(jī)制，有助于從新的角度挖掘小柴胡湯治療乙型肝炎的潛在價值，為后續(xù)進(jìn)一步生物實驗研究與臨床應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：藍(lán)紹航負(fù)責(zé)課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；李娜娜、陶然、廖南盛、蒙蔭杰、何草參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；唐秋媛、毛德文負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。

附錄1～3見二維碼