神經(jīng)損傷誘導(dǎo)蛋白2在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其意義

姜洪剛，薄金紅，岑立勉

(廣西壯族自治區(qū)桂東人民醫(yī)院 神經(jīng)外科，廣西 梧州 543001)

膠質(zhì)瘤是常見的顱內(nèi)腫瘤，復(fù)發(fā)率和死亡率較高[1]。雖然近年來外科技術(shù)和放化療技術(shù)取得了長足進步，但是患者生存預(yù)后仍未見明顯改善[1- 2]。深入分析膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制并尋找潛在的分子生物學(xué)指標(biāo)具有重要意義。神經(jīng)損傷誘導(dǎo)蛋白2 (Ninjurin2) 是一種細(xì)胞黏附分子，可表達(dá)于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞[3]。有研究發(fā)現(xiàn)Ninjurin2可介導(dǎo)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷[4]；Ninjurin2過表達(dá)促進結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖[5]。Ninjurin2在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其意義既往少有報道。本研究旨在探討Ninjurin2對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及侵襲的影響，及其與患者生存預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 組織樣本

選取我院2011年7月至2015年7月手術(shù)切除的88例膠質(zhì)瘤組織。患者術(shù)前均未接受過放療、化療或免疫治療，其中男52例，女36例，年齡21～70歲，平均(47.56±10.02)歲；WHO分級Ⅰ級12例，Ⅱ級24例，Ⅲ級24例，Ⅳ級28例。術(shù)中留取瘤組織，由我院病理科制備石蠟切片(厚度為4 μm)后儲存。另選取2017年6月至2018年12月我院因顱腦損傷而行顱內(nèi)減壓術(shù)切取的正常腦組織30例為對照，其中男15例，女15例，年齡20～59歲，平均(47.01±10.12)歲。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 免疫組化染色法檢測組織中Ninjurin2的表達(dá)水平

70 ℃下烤片30 min，然后進行常規(guī)脫蠟處理；抗原修復(fù)后用羊血清(上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司)封閉30 min，加入抗Ninjurin2抗體(1∶500，英國Abcam 公司)，4 ℃孵育過夜；加入山羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育30 min；隨后進行DAB顯色處理，蘇木紫復(fù)染。經(jīng)脫水、透明、封片處理后在顯微鏡下觀察。根據(jù)細(xì)胞的染色強度及陽性細(xì)胞比例判斷Ninjurin2表達(dá)情況。染色強度評分：陰性、染色為淺黃色、棕黃色、棕褐色分別記0、1、2、3分；陽性細(xì)胞比例評分：0～10%、11%～50%、51%～80%、81%～100%分別記1、2、3和4分。將兩種評分相乘，0～3分為低表達(dá)，4～12分為高表達(dá)[6]。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251、U87和U373和正常膠質(zhì)細(xì)胞系SVG均購自上海慧穎生物科技有限公司。將細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(海晶抗生物工程有限公司)中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。取對數(shù)期生長細(xì)胞進行后續(xù)實驗。取U251細(xì)胞，用Lipofectamine?2000試劑(美國Sigma公司)分別轉(zhuǎn)染Ninjurin2 siRNA序列(Ninjurin2- siRNA組)、陰性對照序列(NC- siRNA組)。質(zhì)粒由上海吉凱基因科技有限公司提供。NC- siRNA序列：5′- GGAGACTACCAGAAGGCTTAT- 3′；Ninjurin2- siRNA序列：5′- GGAGCCTGGAGGAGCC CACGCAG- 3′。轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照試劑說明書操作。

1.4 蛋白免疫印跡法檢測細(xì)胞中Ninjurin2蛋白表達(dá)水平

用RAPI裂解液提取細(xì)胞中的總蛋白，10%SDS- PAGE(上海信裕生物技術(shù)有限公司)分離蛋白，用半干轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。隨后用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入Ninjurin2(1∶500)一抗(英國Abcam 公司)，4 ℃過夜孵育，第2天除去一抗，用TBST緩沖液洗滌3次后加入二抗(羊抗兔，1∶500)，封閉1 h。ECL法顯色，用FP- UVCI- 2100型凝膠成像儀(美國Major Science公司)拍照，用Image J軟件分析灰度值。

1.5 細(xì)胞計數(shù)試劑盒- 8(CCK- 8)法檢測U251細(xì)胞的增殖能力

用CCK- 8(上海李記生物科技有限公司)法檢測細(xì)U251胞增殖能力。取質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，接種于96孔板中，密度為1×104個·孔-1。培養(yǎng)細(xì)胞至貼壁后，于24、48、72和96 h時加入CCK- 8溶液(10 μl·孔-1)。用MR- 96A邁瑞酶標(biāo)儀檢測光密度(OD)值。實驗重復(fù)4次。

1.6 腫瘤小室實驗檢測U251細(xì)胞的侵襲能力

在小室遷移板(上海李記生物科技有限公司)上室鋪基質(zhì)膠，將處于對數(shù)生長期的U251細(xì)胞接種于小室24孔板，以2×105個·ml-1密度將U251細(xì)胞加入上室，下室中加入細(xì)胞培養(yǎng)基。培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后更換上室培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用棉簽小心擦拭去小室濾膜上的瘤細(xì)胞，接著用甲醛固定15 min，行HE染色后光鏡下統(tǒng)計侵襲細(xì)胞數(shù)。實驗重復(fù)4次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Ninjurin2在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)

Ninjurin2蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，細(xì)胞核中也有少量表達(dá)。在膠質(zhì)瘤組織中，Ninjurin2主要染色為淺黃色、棕黃色或棕褐色，而正常腦組織中主要為未著色或者淺黃色(圖1)。膠質(zhì)瘤組織中Ninjurin2蛋白高表達(dá)率為65.91%(58/88)，高于正常腦組織的20.00%(6/30)(χ2=18.998，P<0.001)。U251、U87和U373細(xì)胞中Ninjurin2蛋白相對表達(dá)量分別為(2.11±0.34)、(1.53±0.25)和(1.09±0.27)，均高于SVG細(xì)胞的(0.34±0.08)(均P<0.05)，見圖2。

圖1 Ninjurin2在膠質(zhì)瘤和正常腦組織中的表達(dá)(SP×200) A. 膠質(zhì)瘤組織； B. 正常腦組織

a 與SVG細(xì)胞相比，P<0.05

2.2 膠質(zhì)瘤患者預(yù)后分析

單因素分析結(jié)果顯示，術(shù)前卡氏評分、WHO分級、化療和Ninjurin2是膠質(zhì)瘤患者總生存期的影響因素(均P<0.05)。以是否生存為因變量、上述因素為自變量進行COX多因素分析，結(jié)果顯示，術(shù)前卡氏評分(OR=2.312)、WHO分級(OR=2.008)、化療(OR=1.600)和Ninjurin2(OR=2.816)是膠質(zhì)瘤患者總生存期的獨立影響因素(均P<0.05)，見表1。Kaplan- Meier曲線生存分析結(jié)果顯示，Ninjurin2高表達(dá)組中位生存時間為11個月，明顯低于低表達(dá)組的19個月(P=0.004)，見圖3。

圖3 88例膠質(zhì)瘤患者的生存曲線

表1 影響膠質(zhì)瘤患者生存預(yù)后的單因素和多因素分析

2.3 沉默Ninjurin2對U251細(xì)胞增殖和侵襲的影響

與NC- siRNA組比較，Ninjurin2- siRNA組細(xì)胞增殖和侵襲能力明顯下降(均P<0.05)，見圖4、5。

a 與NC- siRNA組比較，P<0.05

3 討 論

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，發(fā)病可能涉及遺傳、環(huán)境和感染等，患者預(yù)后較差，術(shù)后極易復(fù)發(fā)[7]，因此有必要深入探討膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制。細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附機制近年來受到廣泛關(guān)注，黏附分子可參與生長發(fā)育、免疫炎癥損傷和血液凝固等病理生理過程，它是腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)基礎(chǔ)[8]。Ninjurin2是一種在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的黏附蛋白[3]。有研究顯示，神經(jīng)受損后Ninjurin2表達(dá)水平明顯升高，能夠促進神經(jīng)突起生長[3]，但是其具體的生物學(xué)功能目前尚未明確。Ninjurin2與神經(jīng)炎癥損傷有關(guān)，它可以與Toll樣受體4相互作用，介導(dǎo)下游轉(zhuǎn)錄因子κB和c- Jun通路的激活[9]。激活的受體酪氨酸激酶家族EGFR、VEGFR、FGFR和PDGFR可以激活下游PI3K- Akt- mTOR和 Erk- MAPK通路，參與腫瘤的進展，而Ninjurin2可以與多種受體酪氨酸激酶相互作用[9]，推測Ninjurin2可能參與了腫瘤進展。

Ninjurin2在膠質(zhì)瘤中扮演何種角色，既往未見報道。本研究采用免疫組化染色法檢測了88例膠質(zhì)瘤組織和30例正常腦組織中Ninjurin2的表達(dá)，并采用蛋白免疫印跡法檢測了膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和正常膠質(zhì)細(xì)胞系中Ninjurin2的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對照組相比，膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中Ninjurin2表達(dá)水平較高。既往研究證實，Ninjurin2通過調(diào)節(jié)鈣離子通道活性影響膠質(zhì)瘤組織的增殖[10]，對比本研究結(jié)果提示其可能參與疾病的發(fā)生。為了明確Ninjurin2在膠質(zhì)瘤中的作用，本研究建立了Ninjurin2基因沉默的U251細(xì)胞株，細(xì)胞增殖實驗及腫瘤小室結(jié)果顯示，與NC組(陰性對照組)相比， Ninjurin2沉默的U251細(xì)胞不同時間段的增殖和侵襲能力明顯下降。腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移是腫瘤疾病侵襲性增強的主要特點，上述研究證實，Ninjurin2可能參與了膠質(zhì)瘤的惡化。Li等[5]發(fā)現(xiàn)，Ninjurin2在結(jié)直腸癌細(xì)胞中高表達(dá)，CRSIPR/Cas9敲除Ninjurin2后，細(xì)胞的增殖能力和Akt/Erk通路明顯受到抑制。本研究結(jié)果與之類似。上述結(jié)果提示Ninjurin2高表達(dá)可能影響膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。本研究通過臨床數(shù)據(jù)研究發(fā)現(xiàn)術(shù)前卡氏評分(OR=2.312)、WHO分級(OR=2.008)和化療(OR=1.600)是膠質(zhì)瘤患者總生存期的獨立影響因素，與既往報道[11- 13]一致。但Ninjurin2與腫瘤預(yù)后的關(guān)系既往還未見報道。本研究通過 COX多因素和Kaplan- Meier曲線生存分析結(jié)果證實Ninjurin2是膠質(zhì)瘤患者不良生存預(yù)后的因素，與Ninjurin2低表達(dá)的膠質(zhì)瘤患者相比，Ninjurin2高表達(dá)組的膠質(zhì)瘤患者生存周期明顯縮短，進一步證實Ninjurin2可參與膠質(zhì)瘤進展。

a 與NC- siRNA組比較，P<0.05

綜上，Ninjurin2在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中高表達(dá)，沉默Ninjurin2可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，Ninjurin2高表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者的不良生存預(yù)后有關(guān)。