酶促反應(yīng)芯片研究堿性磷酸酶的酶促反應(yīng)

查春旺 吳劍 王成飛

摘 要：本文采用具有自主知識產(chǎn)權(quán)的酶促反應(yīng)教學(xué)微芯片為基礎(chǔ)結(jié)合新型層析裝置，對堿性磷酸酶的酶促反應(yīng)及其產(chǎn)物進行了初步摸索。通過該芯片可以較為方便的摸索相關(guān)反應(yīng)的不同反應(yīng)條件，方便進行最佳反應(yīng)速度、溫度等的摸索，結(jié)合新型色譜層析裝置可以分離和分析反應(yīng)的產(chǎn)物。相關(guān)設(shè)備便攜性好，可用于相關(guān)知識點的教育教學(xué)，同時考慮到酶促反應(yīng)在人體中的重要地位，本裝置在生物制藥、生物工程、醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：酶促反應(yīng)教學(xué)微芯片;堿性磷酸酶;色譜層析

堿性磷酸酶酶促反應(yīng)實驗是生化實驗中經(jīng)典的反應(yīng)，但是該實驗操作過程較為復(fù)雜，使得相關(guān)實驗只能在實驗室進行。我們將微流控芯片這一分析化學(xué)的熱點技術(shù)[1-3]，引入教學(xué)領(lǐng)域發(fā)展了教學(xué)微芯片，并進一步發(fā)展了酶促反應(yīng)教學(xué)微芯片[4]該芯片可以一次性生成多個不同條件，結(jié)合我們發(fā)展的新型色譜層析裝置[5]，對上述反應(yīng)的產(chǎn)物進行分析，可以發(fā)現(xiàn)這兩個裝置的結(jié)合可以很好的對相關(guān)反應(yīng)進行研究，相關(guān)設(shè)備便攜性好，可用于相關(guān)知識點的教育教學(xué)，同時考慮到酶促反應(yīng)在人體中的重要地位，本裝置在生物制藥、生物工程、醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用前景?，F(xiàn)報道如下：

1 ?實驗部分

1.1 ?試劑、用品和儀器

陶瓷加熱片、PID溫度控制裝置、Pt100感溫探頭、液冷風(fēng)扇、水晶膠、食品級硅橡膠、D1500型自動光刻機、配套光刻板（聊城科天激光設(shè)備有限公司）、小青龍牌食品級硅膠（A、B膠1：1混合）、小青龍牌水晶膠（快干型A、B膠2：1混合）、收音機伸縮天線，品牌： HW（初始長度127mm拉伸320mm天線）（均購自淘寶）。薄層層析硅膠，天津光復(fù)精細化工研究所。

1.2 酶促反應(yīng)芯片制備

采用本課題組的專利技術(shù)制備[4]，過程包括coredraw軟件設(shè)計芯片結(jié)構(gòu)，光刻機光刻制備相關(guān)的管道模板，按A：B=1：1比例混合食品硅膠A、B膠獲得前聚體澆筑到上述

陽模上待其固化，剝離獲得食品硅膠陽模，按A：B=3：1混合水晶膠A、B膠獲得前聚體澆筑到上述陽模表面待其固化，剝離得到水晶膠管道芯片，制備上蓋片，按需要封合芯片即可。

圖1為芯片實物，從中間的兩個進水口1、2注射后兩端的出口處即可不同濃度的溶液，在不同的出口處分別用控溫元件進行溫度控制，即可形成不同條件的反應(yīng)池。

1.3 色譜層析裝置

該裝置按照文獻[5]制備，同樣使用食品級硅膠和水晶膠制備，使用coreldraw軟件設(shè)計的結(jié)構(gòu)是具有凸棱的頂蓋模型和類似手的結(jié)構(gòu)的底座模型。將四個伸縮天線通過熱溶膠分別固定、安裝在頂蓋和底座邊緣，連接二者，且保證頂蓋的貫通槽與底座的凹槽相對應(yīng)，完成器件制作。

1.4 堿性磷酸酶酶促反應(yīng)條件摸索

在實驗時將一定濃度的堿性磷酸酶注射入兩端的在反應(yīng)池中，底物磷酸苯二鈉溶液和水溶液分別從芯片的進樣口1、2注入，在反應(yīng)池中形成不同的濃度，通過芯片兩端反應(yīng)池的控溫元件控制反應(yīng)溫度，可以摸索不同溫度不同底物濃度對該反應(yīng)的影響，可在反應(yīng)池中加入該反應(yīng)的抑制劑Na2HPO4觀察抑制劑對反應(yīng)的影響。

所有反應(yīng)池均在15分鐘后加入0.5mol/L NaOH 0.1 ml以中止反應(yīng)。然后在各反應(yīng)池中加入0.3%的4-氨基安替比林0.1 ml及0.5%鐵氰化鉀0.2 ml，充分混勻，放置10分鐘以將生成的苯酚反應(yīng)成紅色的醌類。

用毛細管蘸取上述各池的反應(yīng)物，點在薄層板上，將薄層板放入上述制備的薄層層析裝置中，按需要一個裝置可同時進行5-10組的薄層層析，通過比較層析板上紅色斑點（苯醌）的顏色深淺可以了解反應(yīng)進行的程度。

2 結(jié)果與討論

不同溫度下控制相關(guān)反應(yīng)，在37oC，生成的苯醌斑點顏色最深，該反應(yīng)的最適合溫度為37oC。如通過ImageJ軟件對斑點進行分析，可得底物濃度和酶促反應(yīng)的關(guān)系，結(jié)果符合米氏方程。在反應(yīng)池體系中加入的Na2HPO4抑制劑可以明顯的降低紅色斑點的顏色。

3 ?結(jié)論

本文綜合應(yīng)用具有自主知識產(chǎn)權(quán)的酶促反應(yīng)微芯片和新型色譜層析裝置，進行了堿性磷酸酶酶促反應(yīng)條件的摸索，該聯(lián)合裝置具有一定的便攜性，反應(yīng)結(jié)果比較明顯，由于采用酶促反應(yīng)芯片節(jié)約了實驗試液的配制時間，也很方便控制不同反應(yīng)池的溫度和抑制劑等多種條件，因此可以快速的對相關(guān)反應(yīng)進行研究，其可以應(yīng)用在課堂教學(xué)中，同時堿性磷酸酶廣泛分布于人體肝臟、骨骼、腸組織是非常重要的酶類，對其進行快速檢測顯然具有重要的意義，因此本裝置未來在生物制藥、生物工程、醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用前景。

參考文獻：

[1]王國陽，白志晨，王佳慧，蘇波，張存林.光譜學(xué)與光譜分析，2021，41（06）：1678-1682.

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[3]李瑋瑋，李雨軒，林金明.分析測試學(xué)報，2021，40（06）：822-827.

[4]查春旺，吳劍，朱丹，海瀟雅，劉慧敏，張思雨，程永婷. 一種酶促反應(yīng)教學(xué)微芯片[P]. 安徽省：CN211586660U，2020-09-29.

[5]吳劍，王成飛，孟嬋嬋，唐玲，王文東，馬雨婷，蔣歡. 一種色譜層析教具及其制備方法[P]. 安徽?。篊N109490463A，2019-03-19.

通訊作者：吳劍。

基金項目：安徽省教育廳教學(xué)研究重點項目（2019jyxm0552），安徽省教育廳高校自然科學(xué)研究重點項目（KJ20180795），安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校校級項目（ZRKXY201910）。