果園生混合干草對羔羊胃腸道細(xì)菌多樣性的影響

李騰飛，劉崇義，靳旭妹，曹馨悅，陳新義，王瑩瑩，龍明秀

（西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

青干草作為反芻動物及其他草食動物重要的飼糧來源，直接影響動物的生長發(fā)育和畜產(chǎn)品質(zhì)量[1]。近年來，隨著人類對高品質(zhì)畜產(chǎn)品的需求不斷增加[2-3]，草地的可持續(xù)利用和優(yōu)質(zhì)飼草的供應(yīng)逐漸成為養(yǎng)殖戶面臨的首要問題[4-5]，“果–草–畜”復(fù)合系統(tǒng)使林果業(yè)與養(yǎng)殖業(yè)有機(jī)結(jié)合，符合可持續(xù)發(fā)展與生態(tài)種養(yǎng)的總體要求，其生產(chǎn)的干草是反芻動物的優(yōu)質(zhì)飼草來源。

反芻動物胃腸道內(nèi)細(xì)菌微生物通過降解宿主本身難以消化的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等物質(zhì)，為機(jī)體提供生長所需的能量和養(yǎng)分。日糧通過影響動物胃腸道微生物菌群組成和多樣性進(jìn)而對胃腸道生理指標(biāo)的變化產(chǎn)生影響，如pH 等。據(jù)報(bào)道[6]，牦牛日糧由高纖維向高谷類轉(zhuǎn)變時，瘤胃微生物代謝產(chǎn)生大量酸性物質(zhì)，導(dǎo)致pH 下降，影響瘤胃微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)。Xue 等[7]研究指出在中國青藏高原地區(qū)不同飼養(yǎng)方式對耗牛瘤胃微生物具有顯著影響。Henderson 等[8]通過分析全程飼喂不同日糧的32 種反芻動物的瘤胃菌群組成發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢菌群主要以普氏菌屬(Prevotella)、丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)和瘤胃球菌屬(Ruminococcus)為主。綜上所述，飼糧組成的多樣化對動物胃腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成具有重要的影響。

在耕地有限和國家實(shí)行“雙減一增”政策的大背景下，如何提高農(nóng)區(qū)土地利用效率，發(fā)展高效安全的畜牧業(yè)成為當(dāng)前研究的重要課題。研究發(fā)現(xiàn)，“果–草”復(fù)合系統(tǒng)能明顯提高果實(shí)可溶性糖、可溶性固形物、維生素C 含量[9]、土壤酶活性和微生物數(shù)量[10]。但對于“果–草–畜”模式下草對反芻動物胃腸道細(xì)菌群落多樣性影響的研究相對較少。本研究基于16S rDNA 測序技術(shù)平臺，通過飼喂不同果園混合干草對薩能奶山羊公羔瘤胃和腸道菌群的組成、菌群多樣性及優(yōu)勢菌群的變化進(jìn)行分析，為渭北旱塬“果–草–畜”生態(tài)種養(yǎng)循環(huán)提供可靠的理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)在渭南市蒲城縣海源種植家庭農(nóng)場進(jìn)行。選取健康的2月齡薩能奶山羊公羔(11.48 ±0.55 kg) 24 只，隨機(jī)分為4 組(按體重相近的原則)，每個處理3 個重復(fù)，每個重復(fù)2 只公羔，試驗(yàn)期85 d(預(yù)飼期15 d、正試期70 d)。試驗(yàn)采取單欄飼養(yǎng)，其中，對照組羔羊飼喂當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖戶配制的混合粗飼料[主要為玉米(Zea mays)秸稈、小麥(Triticum aestivum)秸稈、紫花苜蓿(Medicago sativa)以及少量田間雜草]，其他3 個組為試驗(yàn)組，分別飼喂燕麥草(Avena sativa) + 紫花苜蓿WL168HQ 混合干草(Ⅰ組)、多年生黑麥草(Lolium perenne) + 紫花苜蓿WL168HQ 混合干草(Ⅱ組)、毛苕子(Vicia villosa) + 多年生黑麥草(Ⅲ組)混合干草。

試驗(yàn)日糧配制依照《肉羊飼喂標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 816–2004)[11]》進(jìn)行配制。飼喂前將各組飼草切短(長度為3～5 cm)后按1 ? 1 比例混合后組成混合干草。精料補(bǔ)充料為：玉米68%、麩皮3%、豆粕24%、小蘇打1%、預(yù)混料4% (每千克預(yù)混料含維生素A 2 640 IU、維生素D 340 IU、鐵60.00 mg、鋅48.00 mg、錳48.00 mg、維生素E 26.00 mg、銅12 mg、鈷0.12 mg、碘0.30 mg、硒0.36 mg)。精料飼喂量為羊只體重的0.8%。精飼料與粗飼料分開飼喂，保證料槽中有10%的剩料。4 組日糧精粗比一致，營養(yǎng)水平如表1所列。

表1 各組混合干草的營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Nutrient contents of mixed hay in each group (dry matter basis)

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)前，對試驗(yàn)羊舍進(jìn)行清理和消毒，并對所有試驗(yàn)羊進(jìn)行防疫和體內(nèi)驅(qū)蟲，試驗(yàn)期間所有試驗(yàn)羊均單欄飼喂。每日08:30 和16:30 飼喂，并確保第2日上午飼喂前，料槽內(nèi)仍有10%左右剩料。試驗(yàn)期間，公羔自由采食、自由飲水，及時打掃羊舍，對羊圈定時消毒、通風(fēng)。

1.3 瘤胃及腸道內(nèi)容物的采集與處理

試驗(yàn)期結(jié)束后，每組選擇3 只體重相近的試驗(yàn)羊進(jìn)行屠宰，屠宰后立即采集瘤胃及盲腸內(nèi)容物，并分別置于5 mL 的凍存管中，?80 ℃冰箱保存，用于瘤胃和腸道細(xì)菌微生物區(qū)系測定。

1.4 瘤胃微生物和腸道微生物的16s rDNA 測定

使用E.Z.N.A.?Stool DNA Kit 試劑盒提取細(xì)菌總DNA，瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA 提取質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)對DNA定量。使用341F (5′-CCTACG GGNGGCWGCAG-3′)和805R (5′-GACTACHVG GGTATCTAATCC-3′) 引物擴(kuò)增16S rDNA(V3+V4)可變區(qū)[12]。PCR 擴(kuò)增程序和步驟與Li 等[13]研究論文一致，并由杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司完成。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以“平均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)”表示，在0.05 和0.01 水平上進(jìn)行方差分析。用QIIME 2 程序分析α 多樣性和β 多樣性，用R 3.5.2軟件包繪制圖像。序列比對采用QIIME 2 插件特征分類器，比對數(shù)據(jù)庫為SILVA 和NT-16s，以SILVA數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果為準(zhǔn)，其他圖由Origin 2018 進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同混合干草對腸道菌群多樣性的影響

2.1.1 混合干草對腸道菌群Alpha 多樣性的影響

通過Venn 圖(圖1) 呈現(xiàn)出各處理組共有和特有 的feature 數(shù)目，共檢測到5491 個feature 數(shù)目。不同混合干草組(Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組和CK 組)的feature 數(shù)目分別為1 380、2 068、857 和1 186?？傮w來看，Ⅰ組和Ⅱ組有著較高的feature 數(shù)目。

圖1 混合干草盲腸微生物菌群的feature 數(shù)目Figure 1 Number of intestinal microbial flora of mixed hay

腸道細(xì)菌的多樣性分別用Shannon 指數(shù)、Simpson指數(shù)和Chao1 指數(shù)來解釋(表2)，Ⅱ組的Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)顯著高于其他組(P< 0.05)。且各處理組的Simpson 指數(shù)顯著高于對照組(P< 0.05)。各組中的覆蓋度均接近于99%，說明對腸道微生物具有較高的覆蓋度。綜合結(jié)果表明，Ⅱ組和Ⅰ組中羊腸道微生物具有較高的Alpha 多樣性。

表2 混合干草對盲腸菌群Alpha 多樣性的影響Table 2 Effects of mixed hay on the Alpha diversity of intestinal flora

2.1.2 混合干草對山羊盲腸菌群Beta 多樣性的影響

對不同樣品基于UniFrac 的非加權(quán)主坐標(biāo)分析(PCoA) (圖2b)，第1 主坐標(biāo)(PCoA1) 和第2 主坐標(biāo)(PCoA2)的貢獻(xiàn)率分別為26.35%和15.61%。4 種不同飼養(yǎng)模式下各腸道樣品完全分離，無交叉現(xiàn)象，同組樣品具有明顯的聚集性?；赨niFrac 的非加權(quán)距離的UPGMA 聚類圖(圖2a)可以看出，各組樣品聚類情況較好，每組可單獨(dú)聚為一類，可以看出組內(nèi)樣品相似度高于組間，說明不同混合干草飼喂模式下山羊腸道微生物存在差異。

圖2 混合干草對盲腸菌群Beta 多樣性的影響Figure 2 Effects of mixed hay on the beta diversity of intestinal flora

2.1.3 混合干草對山羊腸道菌群組成影響分析

根據(jù)物種注釋結(jié)果顯示，薩能奶山羊公羔盲腸細(xì)菌一共檢測到27 門(圖3)，可以看出，厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinomycetes)、藍(lán)藻菌門(Cyanophyta) 和擬桿菌門(Bacteroidetes)等是腸道微生物中相對豐度較高的細(xì)菌。Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組厚壁菌門的相對豐度顯著高于CK 組(P< 0.05)，大小依次為Ⅰ組> Ⅱ組 >Ⅲ組 > CK 組；CK 組中，變形菌門的相對豐度顯著高于其他3 組(P< 0.05)；Ⅱ組中擬桿菌門的相對豐度顯著高于其他3 組(P< 0.05)。在屬水平上(圖3)，豐度較高的菌有羅姆布茨菌、勞森氏菌屬、梭狀芽胞桿菌、克里斯滕森菌屬R7、瘤胃球菌屬_NK4A214。Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組中羅姆布茨菌、梭狀芽胞桿菌的相對豐度顯著高于CK 組(P< 0.05)；而勞森氏菌屬則顯著低于CK 組(P< 0.05)。Ⅱ組和CK 組中克里斯滕森菌屬R7 的相對豐度顯著高于Ⅰ組和Ⅲ組(P< 0.05)。

圖3 門、屬水平的盲腸細(xì)菌群落組成Figure 3 Composition of the intestinal bacterial communities in goats at the phylum and genus levels

2.2 混合干草對瘤胃菌群多樣性的影響

2.2.1 混合干草對瘤胃菌群Alpha 多樣性的影響

通過Venn 圖(圖4) 呈現(xiàn)出各處理組共有和特有 的feature 數(shù)目，共檢測到13 055 個feature 數(shù)目。不同混合干草(Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組和CK 組)的feature數(shù)目分別為3 819、3 272、3 423 和2 541。總體來看，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組均有著較高的feature 數(shù)目，從而推斷出使用果園優(yōu)質(zhì)混合干草飼喂山羊，使其瘤胃微生物具有較高的多樣性。

圖4 不同混合干草的瘤胃微生物菌群feature 數(shù)目Figure 4 Number of rumen microbial flora of different hay mixtures

Ⅰ組和Ⅲ組的Chao1 指數(shù)高于其他組，但不顯著(P> 0.05)。且飼用果園混合干草各組的Shannon指數(shù)高于對照組，均沒有達(dá)到顯著差異(P>0.05)。4 組中的覆蓋度指數(shù)均接近于99%，說明對瘤胃微生物具有較高的覆蓋度。綜合結(jié)果表明，Ⅲ組和Ⅰ組羊瘤胃微生物具有較高的Alpha 多樣(表3)。

表3 混合干草對瘤胃菌群Alpha 多樣性的影響Table 3 Effects of mixed hay on the Alpha diversity of rumen flora

2.2.2 混合干草對瘤胃菌群Beta 多樣性的影響

對不同樣品基于UniFrac 的非加權(quán)主坐標(biāo)分析(PCoA) (圖5b)，第1 主坐標(biāo)(PCoA1) 和第2 主坐標(biāo)(PCoA2)的貢獻(xiàn)率為16.69%和13.66%。4 種不同混合干草飼喂下各瘤胃樣品完全分離，無交叉現(xiàn)象，同組樣品具有明顯的聚集性?；赨niFrac 的非加權(quán)距離的UPGMA 聚類圖(圖5a)可以看出，每組樣本的聚類性都很好，而且每組都可以被分為一個單獨(dú)的組。綜合結(jié)果表明，組內(nèi)樣本的相似度高于組間樣本的相似度，不同混合干草飼喂下羔羊瘤胃微生物存在差異。

圖5 混合干草對瘤胃菌群Beta 多樣性的影響Figure 5 Effects of mixed hay on the rumen bacterial Beta diversity

2.2.3 不同混合干草對瘤胃菌群組成分析

根據(jù)物種注釋結(jié)果(圖6 )，薩能公羔瘤胃細(xì)菌共檢測到21 門(phyla)，擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、纖維桿菌門(Fibrobacteres)、螺旋體門(Spirochaetes)、變形菌門(Proteobacteria)是瘤胃微生物中相對豐度較高的細(xì)菌。Ⅲ組中擬桿菌門的相對豐度顯著高于其他3 組(P< 0.05)，但厚壁菌門和纖維桿菌門的相對豐度卻低于其他3 組，且與Ⅰ組和Ⅱ組呈顯著性差異(P< 0.05)；螺旋體門則無顯著性影響(P> 0.05)；Ⅱ組的變形菌門相對豐度顯著高于其他3 組(P< 0.05)。在屬水平上，普氏菌屬(Prevotella)、理研菌科(Rikenella)RC9、纖維桿菌屬(Cellulomonas) 和克里斯滕森菌屬(Christensenella) R7 等屬為瘤胃細(xì)菌群落中的優(yōu)勢菌屬。其中，Ⅲ組普氏菌屬的相對豐度顯著高于其他組(P> 0.05)；Ⅱ和Ⅲ組中理研菌科RC9 的相對豐度顯著高于CK 組(P> 0.05)，而纖維桿菌屬則剛好相反；克里斯滕森菌屬R7 各組間無顯著差異。

圖6 門、屬水平的瘤胃細(xì)菌群落組成Figure 6 Composition of the goat rumen bacterial communities at the phylum and genus levels

3 討論

3.1 混合干草對羔羊瘤胃和盲腸菌群多樣性的影響

細(xì)菌群落的豐富度和均勻度等指標(biāo)可以通過樣品中的feature 數(shù)目和Alpha 多樣性分析來表示。反芻動物瘤胃微生物多樣性與日糧組成、健康狀態(tài)及管理等因素密切相關(guān)，而飼糧組成是影響群落多樣性及結(jié)構(gòu)的重要因素[14-15]。日糧成分越復(fù)雜，瘤胃微生物多樣性就越高[16]，粗蛋白更有利于瘤胃微生物的分解利用[17]。本研究瘤胃樣本與CK 相比，Ⅰ組(3 819)、Ⅱ組(3 272)和Ⅲ組(3 423)均有著較高的feature 數(shù)目。腸道作為大量微生物存在的棲息地，形成了復(fù)雜獨(dú)特的腸道微生態(tài)系統(tǒng)[18]，且作為宿主生命的有機(jī)組成部分，對其生長發(fā)育具有非常重要的影響[19]。本研究腸道樣品中Ⅰ組(1 380) 和Ⅱ組(2 068)有著較高的feature數(shù)目，這與Zheng 等[20]在日糧中添加菊苣(Cichorium intybus)草料增加雞腸道微生物群落多樣性而有益于腸道健康研究結(jié)果一致?？傮w來看，使用紫花苜蓿 + 多年生黑麥草和紫花苜蓿 + 燕麥混合干草飼喂羔羊，使其胃腸道細(xì)菌微生物有著較高的多樣性?；贐eta 多樣性對瘤胃和盲腸菌群進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)每組均單獨(dú)聚為一類，組內(nèi)樣品相似度高于組間，說明不同混合干草飼喂下羔羊瘤胃和盲腸細(xì)菌群落均存在差異。劉桂芹等[21]研究發(fā)現(xiàn)飼喂方式對驢盲腸細(xì)菌群落多樣性，且各組單獨(dú)聚為一類，與本研究結(jié)果相同。同樣，不同料重比的豬基于Beta 多樣性的腸道微生物結(jié)構(gòu)存在顯著差異[22]。

3.2 混合干草對羔羊瘤胃和盲腸菌群結(jié)構(gòu)的影響

在腸道細(xì)菌群落中，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組厚壁菌門的相對豐度顯著高于CK 組，其大小依次為Ⅰ組 >Ⅱ組 > Ⅲ組 > CK 組；Ⅱ組的擬桿菌門相對豐度顯著高于其他3 組。大量研究結(jié)果表明，厚壁菌門和擬桿菌門是反芻動物腸道菌群中的優(yōu)勢菌群[23-24]，厚壁菌能促進(jìn)腸道微生物分解纖維素，類桿菌是促進(jìn)碳水化合物利用的優(yōu)勢菌群[25-26]。本研究中，飼用果園混合干草各組與對照組相比在厚壁菌門相對豐度占比中凸顯出了絕對優(yōu)勢，其分別占Ⅰ組(92.77%)、Ⅱ組(87.74%)和Ⅲ組(76.98%)；而飼用紫花苜蓿 + 多年生黑麥草混合干草(Ⅱ組)，在擬桿菌門相對豐度中占有一定優(yōu)勢，其相對豐度達(dá)到了5.16%。與吳海麗[27]在不同季節(jié)圈養(yǎng)巖羊腸道微生物厚壁菌門72.73%、擬桿菌門16.61%的含量基本一致。變形菌門是中除包含纖維素降解菌、半纖維素降解菌、蛋白質(zhì)降解菌等以外，還包含很多如大腸桿菌、沙門氏菌、幽門螺桿菌等致病菌，容易引起動物腹瀉等疾病[28]。本研究中，對照組中的變形菌門相對豐度顯著高于其他3 組，這表明飼用果園優(yōu)質(zhì)混合干草對平衡腸道菌群具有重要的作用。

在瘤胃細(xì)菌多樣性中，薩能奶山羊公羔瘤胃細(xì)菌在門水平共檢測到21 種，擬桿菌門(38.28%～54.93%)、厚壁菌門(32.65%～42.77%)、纖維桿菌門(2.20%～8.94%)、螺旋體門(2.97%～5.35%)、變形菌門(1.20%～2.91%)是瘤胃中高豐度的細(xì)菌。許多研究表明，類桿菌、厚壁菌和變形桿菌是反芻動物瘤胃中的3 種優(yōu)勢菌[29-30]。魏園等[31]對梅花鹿瘤胃微生物的研究發(fā)現(xiàn)，在飼喂柞樹(Quercus mongolica)葉時，擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門的豐度在生物總量的90%以上，而本研究中各組的擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門的總豐度在79.91%～89.39%，二者結(jié)論相似，陳麗娟等[32]在對不同比例構(gòu)樹(Broussonetia papyrifera)與苜?；旌蠈Π哺袼鼓概Ａ鑫讣?xì)菌多樣性的影響研究中也證明，這3 種細(xì)菌豐度總量在80% 以上；Kim 等[33]利用16S rRNA 基因測序技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)反芻動物瘤胃菌群中厚壁菌門(57.8%) 和擬桿菌門(26.7%) 在數(shù)量上占主導(dǎo)地位。進(jìn)一步驗(yàn)證瘤胃微生物群落總體是以這3 種菌群為優(yōu)勢群落。從屬水平來看，纖維桿菌屬是纖維桿菌門下的唯一菌屬[34]，本研究中，飼喂多年生黑麥草 + 毛苕子混合干草使纖維桿菌的豐度顯著降低，不利于纖維桿菌的生長。普氏菌廣泛參與多種微生物的代謝，具有高活性降解半纖維素和適應(yīng)不同膳食結(jié)構(gòu)的能力，在蛋白質(zhì)、淀粉、木聚糖和果膠的降解中起著重要作用[35]。

多年生黑麥草 + 毛苕子組普氏菌屬的相對豐度顯著高于CK 組，說明飼喂多年生黑麥草 + 毛苕子混合干草能在一定程度上增加普氏菌的數(shù)量，進(jìn)而提高半纖維素的分解效率。

此外，根據(jù)現(xiàn)有的細(xì)菌數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)了大量未鑒定菌屬，這可能是薩能奶山羊瘤胃內(nèi)獨(dú)特的微生物菌群，在今后的研究中有待于進(jìn)一步發(fā)掘。

4 結(jié)論

本研究表明，不同混合干草飼喂薩能奶山羊公羔時，可以提高瘤胃及腸道細(xì)菌群落多樣性，改善胃腸道微生物區(qū)系，通過增加胃腸道中有益細(xì)菌的豐度和減少致病菌的豐度來促進(jìn)營養(yǎng)代謝，促進(jìn)健康，其中以紫花苜蓿 + 多年生黑麥草混合干草效果最佳。