檸檬酸添加劑對(duì)圓葉決明青貯飼料營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)與發(fā)酵特性的影響

韓雪林，史文嬌，張 娟，張 磊，李蘇濤，馮啟賢，陽(yáng)伏林

（福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)，福建 福州 350002）

圓葉決明(Chamaecrista rotundifolia)為豆科多年生草本植物，草質(zhì)柔軟，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富(與南方廣泛應(yīng)用的豆科牧草接近)，是一種新發(fā)現(xiàn)的飼、肥兼用的牧草[1-2]。圓葉決明具有較強(qiáng)的抗逆性、適應(yīng)性和再生性，并且既耐旱又耐高溫、病蟲害少，對(duì)環(huán)境條件要求低，在營(yíng)養(yǎng)匱乏和酸性環(huán)境中生長(zhǎng)良好，固氮能力強(qiáng)，適宜在南方進(jìn)行大面積種植[3-4]。在飼喂草食性動(dòng)物的過程中發(fā)現(xiàn)圓葉決明對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育及生理變化等有顯著的促進(jìn)作用，諸多養(yǎng)殖場(chǎng)已投入生產(chǎn)實(shí)踐[1,5-6]。但新鮮的圓葉決明牧草含有堿性物質(zhì)、味甘、單寧含量高、適口性差[7]，且南方多雨，草料儲(chǔ)存易受濕熱環(huán)境影響發(fā)霉變質(zhì)，因此對(duì)圓葉決明進(jìn)行青貯處理不僅能改善飼料適口性，而且能夠延長(zhǎng)保存時(shí)間。酸度是影響青貯飼料的一個(gè)重要因素，適宜的酸度能很好地調(diào)節(jié)青貯飼料的適口性，而酸度過低會(huì)有酸澀等現(xiàn)象[8]。檸檬酸(citric acid, CA)是一種應(yīng)用廣泛的酸化劑和抗氧化劑，比青貯飼料中常用的甲酸和乙酸更安全[9]，可通過微生物發(fā)酵獲得，生產(chǎn)成本低[10]。發(fā)酵過程中，CA 能迅速降低pH，抑制霉菌、酵母菌等不良菌群的繁殖活動(dòng)，提高青貯發(fā)酵品質(zhì)[11]；同時(shí)CA 作為發(fā)酵底物，為乳酸菌提供碳源，促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)[12]；此外，乳酸菌能將CA 代謝生成具有香味的雙乙酰和乙酸等物質(zhì)[13-14]，可改善青貯飼料適口性。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)圓葉決明的研究還停留在套作、品種選育上，對(duì)其青貯技術(shù)的研究還未見報(bào)道，因此開發(fā)圓葉決明青貯技術(shù)，在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用具有巨大的意義和價(jià)值。

本研究主要通過添加不同水平CA 對(duì)圓葉決明進(jìn)行不同天數(shù)的青貯發(fā)酵，分析比較圓葉決明青貯發(fā)酵前后的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，評(píng)定發(fā)酵品質(zhì)，闡明CA 及不同發(fā)酵程度對(duì)圓葉決明青貯品質(zhì)的影響，為圓葉決明在飼養(yǎng)生產(chǎn)上更好的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用采自福建省漳州市漳浦縣萬安農(nóng)場(chǎng)的結(jié)莢期圓葉決明作為青貯原料，距離地面8～10 cm 處進(jìn)行刈割。添加劑檸檬酸(AR ≥ 99.0%)阿拉丁，購(gòu)于福州麥力生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共分為5 個(gè)試驗(yàn)組和3 個(gè)青貯時(shí)間處理。5個(gè)試驗(yàn)組分別添加0(CK)、0.1% (Ⅰ)、0.3% (Ⅱ)、0.5% (Ⅲ)、1.0% (Ⅳ)的CA，CA 添加量為占青貯原料鮮重(fresh matter, FM)百分比(25 mL·kg?1)，CK 組加等量蒸餾水。設(shè)置青貯時(shí)間30、45 和60 d，每個(gè)試驗(yàn)組每個(gè)青貯時(shí)間處理各3 個(gè)重復(fù)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 青貯樣品的制備

將采集的圓葉決明鮮草樣室溫存放晾曬至24 h，用鍘草刀切成1～2 cm 小段，切碎后混合均勻。按試驗(yàn)設(shè)計(jì)將添加劑或蒸餾水(CK)均勻噴灑在每個(gè)處理的2 kg 樣品上，充分混勻后，迅速分裝入青貯袋中，每袋約400 g，抽出空氣達(dá)到真空狀態(tài)后封口，室溫存放發(fā)酵30、45 和60 d 后測(cè)定化學(xué)成分及發(fā)酵指標(biāo)含量。

1.3.2 測(cè)定指標(biāo)與方法

基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)指標(biāo)：青貯30、45 和60 d 后每個(gè)處理各隨機(jī)抽取3 袋開封，將樣品混合均勻后，取200 g 樣品65 ℃烘箱中烘至恒重，測(cè)定干物質(zhì)(dry matter, DM)含量、測(cè)定粗蛋白(crude protein, CP)含量參考標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 6432-2018)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber, NDF)含量(GB/T 20806-2006)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber, ADF)含量和水溶性碳水化合物 (water soluble carbohydrate, WSC)含量[15]。

青貯發(fā)酵特性分析：取10 g 代表性樣品放入250 mL 錐形瓶中加入90 mL 蒸餾水，4 ℃冰箱浸提24 h 后，4 層紗布和定性濾紙過濾，一部分濾液用于測(cè)定pH[16]，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次；另一部分通過0.22 μm 的濾篩過濾后分裝，?20 ℃保存，用于測(cè)定氨態(tài)氮[17](NH3-N) 、有機(jī)酸[乳酸(lactic acid, LA)、乙酸(acetic acid, AA)和丙酸(propionic acid, PA)]含量[18]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2013 整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用SPSS 20.0 進(jìn)行單因素和雙因素方差分析與多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 圓葉決明鮮草營(yíng)養(yǎng)成分

圓葉決明鮮樣中DM 含量為25.00%，干樣中的CP 含量為18.08%、NDF 含量為60.49%、ADF 含量為41.18%、WSC 含量為3.50%，鮮樣pH 為6.07。

2.2 不同檸檬酸水平及發(fā)酵時(shí)間對(duì)圓葉決明青貯飼料營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響

CA 對(duì)圓葉決明青貯各營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)影響顯著(P<0.05)，除DM 外發(fā)酵時(shí)間對(duì)其他營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)影響顯著(P< 0.05)。檸檬酸和發(fā)酵時(shí)間的交互作用對(duì)NDF和ADF 含量影響顯著(P< 0.05)，對(duì)其他營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)影響不顯著(P> 0.05)。青貯30 d 時(shí)，圓葉決明有較高的DM 含量，Ⅳ處理組最高，為27.21% (表1)。青貯30、45 和60 d 時(shí)，CP 含量均以Ⅳ組最高，分別為16.94%、16.51%和15.64%，顯著高于CK 組(P< 0.05)，但青貯30 d 與45 和60 d 間差異不顯著(P> 0.05)。隨著青貯周期的延長(zhǎng)，NDF 和ADF 含量呈先升高后下降趨勢(shì)。青貯30、45 和60 d 時(shí)，Ⅳ組的NDF和ADF 含量均顯著低于CK 組，其中，NDF 含量分別降低4.64%、5.29% 和2.13%；ADF 含量分別降低2.39%、2.49%和1.72%。青貯60 d 時(shí)，各處理NDF 和ADF 含量最低，且均以Ⅳ組最低，分別為54.25%和40.94%；各處理NDF 含量與30 和45 d相比差異顯著(P< 0.05)，CK 組和Ⅰ組的ADF 含量與30 和45 d相比差異顯著(P< 0.05)。CA 對(duì)圓葉決明WSC 含量無顯著作用(P> 0.05)，青貯30、45 和60 d 時(shí)，均以Ⅳ組的WSC 含量最高，其中，青貯30 d 的Ⅳ組最高，為1.33%。

表1 不同處理及發(fā)酵時(shí)間對(duì)圓葉決明青貯飼料營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響Table 1 Effects of different treatments and fermentation times on the nutrient composition of Chamaecrista rotundifolia silage

2.3 不同檸檬酸水平及發(fā)酵時(shí)間對(duì)圓葉決明青貯飼料發(fā)酵特性的影響

CA 及發(fā)酵時(shí)間對(duì)圓葉決明各發(fā)酵指標(biāo)均有影響顯著(P< 0.05)，二者的交互作用對(duì)圓葉決明青貯NH3-N/TN 及PA含量影響顯著(P< 0.05)，對(duì)pH、LA 和AA 含量無顯著性影響(P> 0.05)。在各青貯周期中，隨著CA 含量的增加各處理圓葉決明青貯pH 均呈下降趨勢(shì)。與CK 組相比，其他試驗(yàn)組pH 顯著降低(P< 0.05)，且pH 均在5.0 以下。各青貯期試驗(yàn)組NH3-N/TN 均顯著降低(P< 0.05)，且均以Ⅳ組的NH3-N/TN 最低，分別下降了2.89%、3.78%和3.60%。青貯30 d 時(shí)NH3-N/TN 顯著低于60 d (P<0.05)，且Ⅳ組的NH3-N/TN 最低，較60 d 時(shí)低0.53%。各試驗(yàn)組LA 含量均顯著高于CK 組(P< 0.05)，但各試驗(yàn)組間差異不顯著(P> 0.05)。各處理組均以青貯30 d 時(shí)LA含量最高。青貯30 和45 d，Ⅲ組的AA 含量顯著低于CK 組和試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ組(P<0.05)。青貯60 d 時(shí)，Ⅲ和Ⅳ組的AA 含量顯著低于CK 組(P< 0.05)。各試驗(yàn)組PA 含量均顯著低于CK組(P< 0.05)，青貯30、45 和60 d 時(shí)，Ⅲ組的PA 含量均最低(P< 0.05)，但各青貯期PA 含量差異不顯著(P< 0.05) (表2)。

表2 不同處理及發(fā)酵時(shí)間對(duì)圓葉決明青貯飼料發(fā)酵特性的影響Table 2 Effects of different treatments and fermentation times on the fermentation characteristics of Chamaecrista rotundifolia silage

3 討論

3.1 檸檬酸及發(fā)酵時(shí)間對(duì)圓葉決明青貯飼料營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響

DM 含量不僅決定了青貯飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量，更是青貯發(fā)酵啟動(dòng)的關(guān)鍵因素。青貯過程中，由于植物細(xì)胞的呼吸作用及微生物發(fā)酵，會(huì)造成青貯原料DM 損失[19]，酸性添加劑能加速飼料酸化，抑制蛋白降解和有害菌的繁殖活動(dòng)，減少青貯過程中飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失[20]。本研究中，各試驗(yàn)組DM含量均高于CK 組，當(dāng)CA 添加量為1.0%時(shí)，DM 含量最高，這說明CA 的添加為青貯提供了額外的發(fā)酵底物，同時(shí)形成的酸性壞境抑制了有害菌的活性，青貯原料DM的損耗降低。經(jīng)CA處理后能提高WSC濃度，這與張晴晴等[21]在燕麥(Avena fatua)青貯發(fā)酵中添加有機(jī)酸后WSC 含量高于CK 組的結(jié)果基本一致。青貯期對(duì)圓葉決明WSC 的消耗較低可能是因?yàn)橛袡C(jī)酸CA 本身提供了額外發(fā)酵底物，同時(shí)有機(jī)酸的添加得到較低的pH，抑制了青貯期不良菌群的繁殖活動(dòng)[22-23]。各試驗(yàn)組圓葉決明青貯CP 含量升高，Ke 等[16]在苜蓿青貯中添加不同濃度檸檬酸后蛋白含量增加且隨添加量不斷增加蛋白含量上升，這與本研究結(jié)果一致。這說明添加CA 能抑制青貯料蛋白質(zhì)的降解。飼料中纖維含量越高，青貯發(fā)酵越難，青貯料適口性越差。本研究中，CA 處理顯著降低了圓葉決明中的NDF 和ADF 含量。這與Zi 等[24]在王草(Pennisetum purpureum)青貯中添加檸檬酸及隨青貯時(shí)間的延長(zhǎng)青貯料的NDF 和ADF 含量降低的結(jié)果基本一致，這說明CA 有一定的酸化能力，能破壞完整穩(wěn)定的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，降低圓葉決明纖維含量，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[25-26]。Ke 等[22]的研究表明0.5% CA 處理對(duì)紫花苜蓿(Medicago sativa)NDF 和ADF 含量無顯著影響，而本研究中添加0.5%和1.0%的CA 能夠顯著降低圓葉決明青貯料的NDF 和ADF 含量，這可能是因?yàn)楸狙芯克玫亩箍颇敛輬A葉決明纖維含量較高。由此可見，CA 能夠改善圓葉決明青貯營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，當(dāng)添加水平為0.5%和1.0%時(shí)，青貯營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)改善效果最好，且二者之間差異不顯著。

青貯營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)隨發(fā)酵時(shí)間的變化不斷變化。除DM 外，發(fā)酵時(shí)間對(duì)其他營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)均影響顯著，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，各組DM、CP 和WSC 含量均有不同程度的降低，NDF 和ADF 的含量呈現(xiàn)上下浮動(dòng)，在青貯60 d 時(shí)，各組DM、CP 和WSC 含量與原料相比損耗最多，NDF 和ADF 含量最低。其含量變化與盧強(qiáng)等[27]、張放等[28]和王子苑等[29]報(bào)道的青貯料營(yíng)養(yǎng)成分動(dòng)態(tài)變化規(guī)律一致。這說明較長(zhǎng)的發(fā)酵時(shí)間需要更多的底物和能量去維持微生物的生長(zhǎng)繁殖、促進(jìn)發(fā)酵的進(jìn)行，導(dǎo)致青貯料中所殘留的DM、CP 和WSC 含量相對(duì)降低；青貯原料存放過程中纖維素的部分降解及低pH 對(duì)飼料纖維酸化程度更強(qiáng)，造成NDF 和ADF 含量降低。王致敬等[30]研究表明隨青貯時(shí)間延長(zhǎng)鳳梨(Ananas comosus)渣青貯CP 含量逐漸增加，與本研究結(jié)果不一致，這可能是因?yàn)閳A葉決明WSC 含量較低，無法滿足微生物發(fā)酵所需能量，在青貯過程中消耗利用了部分蛋白質(zhì)，使CP 含量降低。毛翠等[31]的研究中表明玉米(Zea mays)各組隨青貯時(shí)間延長(zhǎng)，NDF 含量增加，ADF 含量降低，與本研究結(jié)果不一致，這可能是由全株玉米與本研究所用圓葉決明的類型、添加劑種類及發(fā)酵天數(shù)不同造成的。因此，不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)圓葉決明青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響不同，發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)消耗的底物越多，但消耗的纖維含量越少。

檸檬酸添加劑與發(fā)酵時(shí)間的交互作用對(duì)NDF和ADF 含量影響顯著，對(duì)其他營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)影響不顯著，這說明二者的交互作用中檸檬酸是影響圓葉決明青貯營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的關(guān)鍵因素。發(fā)酵時(shí)間主要影響纖維成分。

3.2 檸檬酸及發(fā)酵時(shí)間對(duì)圓葉決明青貯飼料發(fā)酵特性的影響

青貯飼料pH 在發(fā)酵特性評(píng)價(jià)中起至關(guān)重要的作用，低pH 可以抑制不良酵母和霉菌[32]，提升飼料發(fā)酵品質(zhì)。因此，通過添加CA 快速降低pH，抑制不良菌群，提高發(fā)酵品質(zhì)。本研究中，CA 處理組的pH 與CK 組的相比顯著降低，且隨CA 含量增加pH 不斷降低，其值均在5.0 以下，這與Ke 等[16]研究結(jié)果一致，說明CA 可促進(jìn)圓葉決明青貯發(fā)酵，為乳酸菌提供發(fā)酵底物，增強(qiáng)產(chǎn)乳酸能力，導(dǎo)致青貯飼料pH 降低。但Li 等[33]的研究表明CA 的添加導(dǎo)致紫花苜蓿青貯飼料pH 升高，與本研究的結(jié)果不一致，這可能是因?yàn)楸狙芯克脠A葉決明與紫花苜蓿相比具有較強(qiáng)的酸度和較低的緩沖能力。NH3-N/TN反映了飼料蛋白降解程度，比值越小說明飼料蛋白保存越好。本研究中CA 的添加顯著降低了NH3-N/TN，其中1.0%CA 組NH3-N/TN 最低，這一結(jié)果與He 等[34]和Ke 等[16]的研究結(jié)果一致，這是因?yàn)橛袡C(jī)酸的添加降低了pH，抑制了植物蛋白酶的活性和較弱的耐酸細(xì)菌及不良微生物發(fā)酵，較大程度地保留了蛋白質(zhì)含量；也可能是因?yàn)閳A葉決明中的的單寧含量較高，濃縮單寧與蛋白質(zhì)有較高的親和力，在飼料發(fā)酵過程中保護(hù)蛋白質(zhì)不被降解[35-36]。乳酸是青貯的主要發(fā)酵產(chǎn)物，是青貯發(fā)酵特性的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。CA 的添加降低了青貯環(huán)境pH，抑制有害菌的生長(zhǎng)，同時(shí)為乳酸菌提供能量，加快乳酸菌的生長(zhǎng)，促進(jìn)發(fā)酵進(jìn)程[33]。本研究中，CA 顯著提高了圓葉決明青貯料的LA 含量，但不同的添加水平對(duì)LA 含量的影響不同，低濃度0.1% 的乳酸含量最高。Ke 等[16]研究表明CA 能顯著提高紫花苜蓿青貯LA 含量，且隨CA 的增加，LA 含量逐漸降低，這與本研究結(jié)果基本一致，說明高濃度的CA 形成較強(qiáng)的酸性環(huán)境，抑制了乳酸菌的活性，削弱了乳酸菌產(chǎn)乳酸的能力，進(jìn)而LA 含量降低。青貯后AA 和PA 含量降低，當(dāng)CA 水平為0.5%時(shí)AA 和PA 含量最低(P< 0.05)，Li 等[37]的研究表明當(dāng)CA 添加量為0.5% 時(shí)木薯(Manihot esculenta)的AA 含量基本不變，PA 含量顯著低于對(duì)照組。這可能是因?yàn)楸狙芯克玫膱A葉決明與木薯葉營(yíng)養(yǎng)成分不同，CA 對(duì)其的作用也有差異，同時(shí)CA 可以直接酸化飼料，快速形成酸性環(huán)境，抑制乳酸菌對(duì)乳酸和檸檬酸的作用，降低了乙酸含量[38-39]。由此可見，青貯中添加CA 能提高圓葉決明發(fā)酵品質(zhì)，當(dāng)CA 添加量為0.5%時(shí)效果最佳。

青貯30、45 和60 d 時(shí)CK 組的pH 無顯著變化，且高于5.0，這說明圓葉決明很難直接青貯，發(fā)酵天數(shù)對(duì)其單獨(dú)青貯無顯著性影響。隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，能觀察到隨CA 含量的增加不同發(fā)酵時(shí)間段對(duì)青貯料pH 的影響降低，說明CA 水平與發(fā)酵天數(shù)的交互作對(duì)pH 的影響不顯著。圓葉決明青貯NH3-N/TN隨青貯周期延長(zhǎng)不斷升高，這在賈戌禹等[40]的研究中得到相似的結(jié)果。隨著CA 添加量的增加NH3-N/TN 隨青貯周期延長(zhǎng)升高的比例越來越小，這說明微生物發(fā)酵隨青貯期延長(zhǎng)，消耗更多的底物，蛋白質(zhì)降解相對(duì)增多，但CA 水平與發(fā)酵天數(shù)的交互作用減少了NH3-N 的產(chǎn)生，有效保留了青貯料CP 含量。青貯過程中LA 含量呈下降趨勢(shì)，在青貯45 和60 d 后LA 含量降低且差異不顯著，可能是因?yàn)榍噘A30 d 時(shí)乳酸的大量積累，抑制了后期乳酸菌的活性，減少了乳酸的產(chǎn)生[41]。但Lyu 等[42]報(bào)道隨青貯時(shí)間延長(zhǎng)陽(yáng)春砂(Fructus Amomi)青貯料中LA 含量逐漸升高，與本研究結(jié)果不一致，這可能是本研究所用的圓葉決明為豆科牧草，陽(yáng)春砂為姜科植物，兩種研究用草類型及青貯時(shí)長(zhǎng)不一樣所致。青貯料AA 含量隨發(fā)酵天數(shù)的增加有波動(dòng)，但整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這與鄒詩(shī)雨等[43]和劉桂要[44]的研究結(jié)果不一致，可能是因?yàn)樵谇噘A60 d 時(shí)，青貯料的pH 過低，抑制了醋酸菌的活動(dòng)，減少了AA 的產(chǎn)生。PA 具有抑菌作用，在青貯原料中含量較低[45]。在青貯30 和45 d 時(shí)PA 含量呈下降趨勢(shì)，但在青貯60 d 時(shí)，PA 含量顯著升高，與陳鑫珠等[46]在不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌糠發(fā)酵品質(zhì)的研究中發(fā)現(xiàn)發(fā)酵60 d 后PA 含量顯著升高的結(jié)果一致。總體來看，不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)圓葉決明發(fā)酵特性的影響不一，青貯時(shí)間短，發(fā)酵特性較好。

本研究中，檸檬酸與發(fā)酵時(shí)間的交互作用對(duì)圓葉決明pH、LA 和AA 無顯著影響，但檸檬酸是影響青貯pH、LA 和AA 含量的主要因素，青貯時(shí)間對(duì)NH3-N/TN 和PA 的影響顯著。

4 結(jié)論

添加CA 后能夠有效改善圓葉決明青貯品質(zhì)，在CA 添加量為0.5%和1.0%時(shí)圓葉決明青貯營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)效果最好，CA 添加量為0.5%時(shí)圓葉決明發(fā)酵特性效果最佳；檸檬酸與發(fā)酵時(shí)間的交互作用顯著影響了NDF、ADF、NH3-N/TN 和PA 含量，對(duì)其他指標(biāo)無顯著影響。綜合經(jīng)濟(jì)、安全、環(huán)保等因素，在圓葉決明青貯時(shí)，當(dāng)CA 添加量為0.5%、青貯時(shí)間為30 d 時(shí)，其青貯品質(zhì)效果最佳。