不同作用機(jī)制殺菌劑對(duì)燕麥炭疽病病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

高 鵬，劉 琳，劉昀鑫，魏江銘，李 瑤，趙 祥

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，山西 太谷 030801）

燕麥(Avena sativa)是世界范圍內(nèi)廣泛種植的糧飼兼用植物。隨著我國(guó)推動(dòng)糧經(jīng)飼統(tǒng)籌和草牧業(yè)的快速發(fā)展，燕麥種植面積逐年擴(kuò)大，但病害問題成為限制其生產(chǎn)的瓶頸[1]。山西晉北地區(qū)是我國(guó)飼用燕麥的主產(chǎn)區(qū)之一，2018 – 2020年，本研究通過對(duì)該地區(qū)燕麥病害調(diào)查發(fā)現(xiàn)，由禾谷炭疽菌(Colletotrichum cereale)引致的炭疽病呈現(xiàn)持續(xù)暴發(fā)流行的特點(diǎn)，病田率和病株率高達(dá)100%，導(dǎo)致大量葉片枯黃，嚴(yán)重時(shí)引起植株早衰，造成嚴(yán)重減產(chǎn)[2-3]。

炭疽菌屬(Colletotrichum) 亦稱刺盤孢屬，為半知菌類真菌，其無(wú)性態(tài)可產(chǎn)生大量直或彎曲的分生孢子。目前已發(fā)現(xiàn)部分種的有性態(tài)為子囊菌門(Ascomycota)小叢殼科(Glomerellaceae) 小叢殼屬(Glomerella)真菌[4]。禾谷炭疽菌的分生孢子呈鐮刀形，次生分生孢子部分變直，其有性態(tài)尚不清楚。在大于90%的空氣濕度或水滴中，分生孢子可萌發(fā)產(chǎn)生黑褐色、卵圓形或近圓形的附著胞[2]，然后發(fā)展形成侵染釘侵入寄主角質(zhì)層或皮層，通過初生菌絲和次生菌絲在寄主葉肉細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)展，同時(shí)分泌細(xì)胞壁降解酶，殺死寄主細(xì)胞獲取營(yíng)養(yǎng)，最后在葉表產(chǎn)生分生孢子盤和分生孢子，借助風(fēng)雨進(jìn)行侵染循環(huán)[5-6]。

禾谷炭疽菌引致的炭疽病是燕麥的主要病害之一，除山西省，在美國(guó)、巴西和加拿大以及中國(guó)的內(nèi)蒙古自治區(qū)和甘肅省等燕麥主產(chǎn)區(qū)均有報(bào)道[1,7]。傳統(tǒng)控制植物病害的方法包括抗病品種選育、生物防治、改善農(nóng)業(yè)措施和化學(xué)防治等。不同防治方法各有利弊，化學(xué)防治具有見效快、防效顯著、操作簡(jiǎn)便和成本較低等特點(diǎn)，但也容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，對(duì)環(huán)境和食品安全造成一定危害[8]。因此，掌握殺菌劑的安全用藥方法，科學(xué)、合理地選擇多種作用機(jī)制的殺菌劑，是有效防治病害的關(guān)鍵[9]。

19 世紀(jì)七八十年代，銅制劑和硫磺等無(wú)機(jī)和金屬類殺菌劑問世以來(lái)，取代苯類、二硫代氨基甲酸酯類、苯并咪唑類、三唑類、甲氧基丙烯酸酯類和酰胺類等不同作用機(jī)制的有機(jī)殺菌劑相繼創(chuàng)制[10]，在防控作物病害、提高全球作物產(chǎn)量、改善人類食品安全和健康狀況等方面發(fā)揮重要作用[8]。但目前尚未見對(duì)燕麥產(chǎn)區(qū)炭疽病采取防治措施，和關(guān)于化學(xué)殺菌劑防治燕麥炭疽病的相關(guān)報(bào)道。鑒于此，本研究通過前期試驗(yàn)初步分析了7 大類12 種殺菌劑對(duì)禾谷炭疽菌的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)除腐霉利和異菌脲等酰胺類殺菌劑外，其余6 大類10 種殺菌劑均有顯著防效，本研究將進(jìn)一步對(duì)其抑制菌落生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的效果進(jìn)行測(cè)定，以期篩選出不同作用機(jī)制的高效低毒殺菌劑，為燕麥炭疽病的田間防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試培養(yǎng)基和菌種：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA) 培養(yǎng)基，馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉17 g，蒸餾水定容到1 L。禾谷炭疽菌菌種分離自山西省大同市天鎮(zhèn)縣的燕麥炭疽病病株，使用單孢分離法純化后于4 ℃冰箱中保存，菌落及分生孢子萌發(fā)特征如圖1 所示。在PDA 培養(yǎng)基上活化30 皿并置于23 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)7 d，用于接種和制備孢子懸浮液。

圖1 燕麥炭疽病菌菌落(a)、分生孢子(b)、芽管(c)、附著胞(d)和菌絲(e)Figure 1 The colony (a), conidium (b), germ tube (c), appressorium (d), and hypha (e) of Colletotrichum cereale on oat anthracnose

供試殺菌劑：供試的10 種殺菌劑均為農(nóng)資市場(chǎng)購(gòu)買，殺菌劑類型根據(jù)殺菌劑抗性行動(dòng)委員會(huì)(FRAC) 2010年分類目認(rèn)定[11]，各殺菌劑的劑型、類型、生產(chǎn)廠家如表1 所列。

表1 供試殺菌劑的基本信息Table 1 Information on the fungicides used in this study

分別采用菌絲生長(zhǎng)速率法和液滴法，在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定各殺菌劑抑制菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的供試濃度，每種殺菌劑設(shè)置5 個(gè)梯度供試濃度(表2)。

表2 供試殺菌劑抑制菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的梯度供試濃度Table 2 Fungicide concentrations for sensitivity assays with mycelial growth and spore germination of Colletotrichum cereale on oat anthracnose

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 含藥培養(yǎng)基的制備

在超凈工作臺(tái)中，使用微量電子天平或移液器稱量對(duì)應(yīng)質(zhì)量或體積的殺菌劑放入滅菌錐形瓶中，使用滅菌量筒量取無(wú)菌水，將各殺菌劑配制成最大供試濃度的10 倍液，然后將10 倍液依次按1/2 倍稀釋，獲得供試濃度的10 倍液。充分搖晃錐形瓶，使藥劑混勻。使用滅菌移液器分別量取1 mL 供試濃度的10 倍液加入9 mL 約50 ℃的PDA 培養(yǎng)基中充分混勻。每個(gè)濃度設(shè)4 個(gè)重復(fù)，以等量無(wú)菌水處理作為對(duì)照。

1.2.2 接種和菌落測(cè)量

用直徑為5 mm 的打孔器在培養(yǎng)7 d 的禾谷炭疽菌菌落邊緣打孔，菌絲一面向下放置在制備好的含藥培養(yǎng)基中央，每皿接種一個(gè)菌餅，置于23 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)至第6 天時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。

菌絲生長(zhǎng)抑制率 = [(對(duì)照菌落直徑 ? 處理菌落直徑) / (對(duì)照菌落直徑 ? 菌餅直徑)] × 100%。

1.2.3 孢子懸浮液的制備

選擇培養(yǎng)7 d 的禾谷炭疽菌菌落，用滅菌毛筆將培養(yǎng)基表面的菌絲輕輕刮下，無(wú)菌水沖洗3 次，5 層無(wú)菌紗布過濾，用血球計(jì)數(shù)器將孢子濃度調(diào)至1 × 105個(gè)·mL?1。

1.2.4 孢子萌發(fā)的測(cè)量

將長(zhǎng) × 寬 × 高為7.5 cm × 2.5 cm × 0.5 cm、中央凹孔直徑1.6 cm、深度0.2 cm 的滅菌單凹載玻片放入底部平鋪2 張滅菌濾紙，并放入用5 mL 無(wú)菌水浸透的培養(yǎng)皿中。使用滅菌移液器吸取0.09 mL 孢子懸浮液和0.01 mL 供試濃度的10 倍液，置于單凹載玻片凹槽中充分混勻，將培養(yǎng)皿封口并置于23 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。在培養(yǎng)12 h 時(shí)，在顯微鏡下觀察分生孢子的萌發(fā)情況。隨機(jī)觀察100 個(gè)孢子，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)的孢子總數(shù)，當(dāng)芽管或菌絲長(zhǎng)度超過孢子直徑的1/2，或產(chǎn)生附著胞時(shí)視為萌發(fā)(圖1)。計(jì)算孢子萌發(fā)率和孢子萌發(fā)抑制率。每個(gè)濃度設(shè)4 個(gè)重復(fù)，以等量無(wú)菌水處理作為對(duì)照。

孢子萌發(fā)率 = (萌發(fā)的孢子數(shù) / 孢子總數(shù)) × 100%；

孢子萌發(fā)抑制率 = [(對(duì)照孢子萌發(fā)率 ? 處理孢子萌發(fā)率) / 對(duì)照孢子萌發(fā)率] × 100%；

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 23.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。將抑制率轉(zhuǎn)換為機(jī)率值，以各殺菌劑供試濃度的對(duì)數(shù)為自變量，對(duì)應(yīng)的抑制率機(jī)率值為因變量，進(jìn)行線性回歸，獲得毒力回歸方程并計(jì)算有效中濃度(EC50)。使用每種殺菌劑的毒力回歸方程計(jì)算抑制率實(shí)測(cè)值對(duì)應(yīng)的預(yù)測(cè)值，并進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，獲得相關(guān)參數(shù)，評(píng)估實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

6 大類10 種殺菌劑對(duì)燕麥炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)均有一定抑制作用，通過對(duì)毒力回歸方程進(jìn)行擬合，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)抑制率的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間差異顯著(P> 0.05)，因此對(duì)EC50的估測(cè)值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，50%多菌靈可濕性粉劑、25%丙環(huán)唑乳油、25%嘧菌酯懸浮劑和25%吡唑醚菌酯懸浮劑對(duì)禾谷炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用最強(qiáng)，EC50分別為0.092 1、0.877 4、0.118 0 和0.002 9 mg·L?1；70%甲基硫菌靈可濕性粉劑、75%百菌清可濕性粉劑和43%戊唑醇懸浮劑的抑制作用次之，EC50分別為1.755 1、2.576 9和1.537 1 mg·L?1；80%代森錳鋅可濕性粉劑、50%福美雙可濕性粉劑和25%溴菌晴可濕性粉劑的抑制作用較弱，EC50分別為10.690 5、4.753 4和5.628 6 mg·L?1(表3)。

表3 不同類型殺菌劑對(duì)燕麥炭疽病病菌菌絲生長(zhǎng)的毒力測(cè)定Table 3 Indoor toxicity tests of various fungicides against mycelial growth of Colletotrichum cereale on oat anthracnose

當(dāng)75%百菌清可濕性粉劑濃度大于0.800 0 mg·L?1時(shí)，孢子萌發(fā)抑制率均為100%；小于0.800 0 mg·L?1時(shí)，對(duì)孢子萌發(fā)無(wú)顯著抑制作用。43% 戊唑醇懸浮劑和25% 丙環(huán)唑乳油對(duì)孢子萌發(fā)均無(wú)顯著抑制作用。對(duì)其余7 種殺菌劑的毒力回歸方程進(jìn)行擬合，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，所得抑菌率的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間差異顯著(P> 0.05)，因此對(duì)EC50的估測(cè)值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，50%多菌靈可濕性粉劑、25%嘧菌酯懸浮劑和25%吡唑醚菌酯懸浮劑對(duì)禾谷炭疽菌孢子萌發(fā)的抑制作用最強(qiáng)，EC50分別為0.112 4、0.118 4 和0.005 9 mg·L?1；80%代森錳鋅可濕性粉劑和50%福美雙可濕性粉劑的抑制作用次之，EC50分別為0.755 3和0.792 9 mg·L?1；70%甲基硫菌靈可濕性粉劑和25%溴菌晴可濕性粉劑的抑制作用較弱，EC50分別為3.188 6 和2.185 8 mg·L?1(表4)。

表4 不同類型殺菌劑對(duì)燕麥炭疽病病菌孢子萌發(fā)的毒力測(cè)定Table 4 Indoor toxicity tests of various fungicides against spore germination of Colletotrichum cereale on oat anthracnose

3 討論

百菌清通過抑制病原菌胞內(nèi)三磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate)的活性，導(dǎo)致谷胱甘肽(glutathione) 及下游蛋白的合成受阻[12]。代森錳鋅和福美雙則對(duì)含有巰基(-SH)或含有金屬的酶活性具有抑制作用[13]。這3 種殺菌劑均具有多位點(diǎn)接觸活性且產(chǎn)生耐藥性風(fēng)險(xiǎn)較低等優(yōu)點(diǎn)，是作物和經(jīng)濟(jì)植物病害防治中普遍使用的保護(hù)性殺菌劑[14]。本研究結(jié)果表明，百菌清、代森錳鋅和福美雙均對(duì)燕麥炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)有顯著抑制作用，其中百菌清的EC50最低，為2.576 9 mg·L?1，且遠(yuǎn)低于對(duì)膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和尖孢炭疽菌(Colletotrichumacutatum)的EC50(173.341 0、151.441 0 mg·L?1)[15]。但作為保護(hù)性殺菌劑，更需要關(guān)注對(duì)孢子萌發(fā)的抑制效果[13]。本研究未得到百菌清濃度和孢子萌發(fā)抑制率的回歸方程，但發(fā)現(xiàn)當(dāng)有效濃度≥ 0.800 0 mg·L?1時(shí)，對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)100%。代森錳鋅和福美雙抑制孢子萌發(fā)的EC50相近，分別為0.755 3 和0.792 9 mg·L?1?？梢?，在相同防效下，百菌清用藥量更低。因此在燕麥炭疽病發(fā)生前，百菌清可作為防治燕麥炭疽病的保護(hù)性殺菌劑。

多菌靈和甲基硫菌靈是以苯丙咪唑環(huán)為母體的一類有機(jī)殺菌劑，通過與真菌菌絲和孢子芽管中的β 微管蛋白(β-tubulin protein)結(jié)合抑制病菌有絲分裂[16]，兼具內(nèi)吸治療和保護(hù)作用，是較早用于防治植物炭疽病的殺菌劑之一。多菌靈抑制燕麥炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的EC50為0.092 1 mg·L?1，低于對(duì)禾生炭疽菌(Colletotrichum graminicola)、亞麻刺盤孢(Colletotrichum linicola)和膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)的EC50(0.9569、0.510 9 和0.1740 mg·L?1)[15,17-18]，也低于聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織允許的最高限量(0.100 0 mg·L?1)[19]，表明該病原尚未對(duì)多菌靈產(chǎn)生抗性。此外，多菌靈對(duì)孢子萌發(fā)也有顯著抑制效果，但孢子對(duì)其敏感性較菌絲要低，因此噴施濃度要與孢子抑制濃度相一致，才能同時(shí)發(fā)揮內(nèi)吸治療和保護(hù)作用。甲基硫菌靈對(duì)燕麥炭疽病菌也具有顯著防效，但其EC50明顯要高，因此多菌靈更適合用于防治燕麥炭疽病。

戊唑醇和丙環(huán)唑?yàn)殓薮济摷谆饔靡种苿?sterol demethylation inhibitors，DMIs)，通過干擾或阻斷病原菌麥角甾醇生物合成發(fā)揮抗菌作用，是目前應(yīng)用最為廣泛的內(nèi)吸性殺菌劑，對(duì)子囊菌和擔(dān)子菌等真菌引起的多種病害具有顯著防效[20]。DMIs 也是目前唯一報(bào)道用于防治禾谷炭疽菌(C.cereale)引致多種禾草炭疽病的一類殺菌劑。在美國(guó)加州，通過分析禾谷炭疽菌對(duì)DMIs 的敏感性，發(fā)現(xiàn)戊唑醇和丙環(huán)唑抑制菌絲生長(zhǎng)的EC50均值分別為0.082 0和0.140 0 mg·L?1[21]，是本研究結(jié)果的18.7 和6.2 倍。而該研究同時(shí)分析了長(zhǎng)期使用DMIs 對(duì)禾谷炭疽菌產(chǎn)生抗藥性的影響，結(jié)果表明，EC50值顯著提高了6.5 倍[21]。由此可見，晉北地區(qū)燕麥炭疽病菌可能對(duì)DMIs 產(chǎn)生了一定的抗藥性，在病害防治中應(yīng)慎重使用。

嘧菌酯和吡唑醚菌酯是近年來(lái)創(chuàng)制的一類新型的醌外抑制劑(quinone outside inhibitors，QoIs)，其殺菌作用與真菌細(xì)胞色素(cytochrome b，Cytb)BC1 酶復(fù)合物Qo 位點(diǎn)的結(jié)合密切相關(guān)，可抑制線粒體的呼吸及能量釋放[22]。孢子萌發(fā)是一種高度依賴能量的生理過程，因此大多數(shù)分生孢子的線粒體被分配到芽管里[15]，這可能是燕麥炭疽病菌孢子對(duì)嘧菌酯和吡唑醚菌酯高度敏感的原因。所有供試殺菌劑中，吡唑醚菌酯是抑制菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)最有效的殺菌劑，兼具保護(hù)和治療作用，且與已報(bào)道對(duì)膠孢炭疽菌和平頭炭疽菌(Colletotrichum truncatum)的EC50相近[14,23]，尚未產(chǎn)生抗性，因此在燕麥炭疽病的防治中優(yōu)先使用。

本研究供試的燕麥炭疽菌種分離自晉北地區(qū)大同市天鎮(zhèn)縣的燕麥種植田，對(duì)該地區(qū)其他市(縣)燕麥病害調(diào)查發(fā)現(xiàn)炭疽病均有發(fā)生，但上述地區(qū)均未采用噴施殺菌劑防治病害，這可能是導(dǎo)致病菌對(duì)供試的大多數(shù)殺菌劑尚未產(chǎn)生明顯抗性的原因。此外，室內(nèi)測(cè)定結(jié)果與田間實(shí)際使用防效可能存在差異，有待進(jìn)一步通過田間試驗(yàn)驗(yàn)證殺菌劑的實(shí)際防效。隨著該地區(qū)燕麥生產(chǎn)規(guī)模擴(kuò)大和種植年限的增加，病害防控形式將愈發(fā)嚴(yán)重，建議生產(chǎn)者高度重視炭疽病的流調(diào)工作，及時(shí)輪換采用不同作用機(jī)制的化學(xué)殺菌劑防控病害，同時(shí)改善種植條件，引進(jìn)和選育抗病品種，保證燕麥的可持續(xù)生產(chǎn)。

4 結(jié)論

本研究通過對(duì)6 大類10 種殺菌劑抑制菌落生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)效果的測(cè)定，證實(shí)對(duì)燕麥炭疽病菌均具有顯著防效，但不同殺菌劑和濃度之間以及對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的抑制效果存在差異。其中多菌靈、丙環(huán)唑、嘧菌酯和吡唑醚菌酯對(duì)禾谷炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用較強(qiáng)；百菌清、多菌靈、嘧菌酯和吡唑醚菌酯對(duì)禾谷炭疽菌孢子萌發(fā)的抑制作用較強(qiáng)。根據(jù)作用機(jī)制的不同，建議百菌清在炭疽病發(fā)生前優(yōu)先作為保護(hù)性殺菌劑使用，多菌靈、嘧菌酯和吡唑醚菌酯作為保護(hù)和治療性殺菌劑使用。