雙酚A暴露誘導雌性大鼠性早熟的下丘腦KISS-1和GPR54基因甲基化分子機制探討*

羅小娟，曹 科△，陶明俊，陳小文，張 琴，彭 剛，陳運生

(廣東省深圳市兒童醫(yī)院：1.檢驗科;2.兒研所;3.內分泌科;4.青春期婦科 518038)

雙酚A(BPA)作為一種環(huán)氧樹脂和聚碳酸酯塑料的重要化工原料，廣泛存在于人類日常生活用品和生存環(huán)境中，并可通過消化道、呼吸道和皮膚等途徑暴露于人類，引發(fā)公共健康和安全問題[1-3]。近年來，女童性早熟發(fā)病率存在明顯上升趨勢，隨著人體血液、尿液等生物標本BPA的檢出，其對雌性個體青春發(fā)育和內分泌的干擾作用及對生殖系統(tǒng)的毒性機制，引起公眾和學術界的廣泛關注。有研究認為BPA通過擬雌激素樣作用，干擾人類內分泌系統(tǒng)的平衡和生殖系統(tǒng)的正常發(fā)育和功能，可能與女童特發(fā)性中樞性性早熟(ICPP)的發(fā)生、發(fā)展有關[4-6]，但其確切的致病機制尚未闡明。青春期啟動與發(fā)育是遺傳基因與環(huán)境因素共同作用的結果，新近研究認為 BPA暴露可能通過干擾和改變DNA甲基化等基因表觀遺傳學方式影響生殖系統(tǒng)的正常發(fā)育和功能[7-10]。下丘腦KISS-1/GPR54基因對促性腺軸的啟動至關重要，KISS-1基因編碼蛋白kisspeptin通過與受體蛋白GPR54結合，可刺激GnRH釋放而啟動下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamic-pituitary-gonadal axis，HPGA)，且其促性腺激素效應的基本位點在下丘腦GnRH神經元內，且是唯一通過GPR54介導的表達來實現。目前，國內外先后運用各種最新技術手段對KISS-1/GPR54基因變異和多態(tài)性進行檢測分析，結果表明KISS-1/GPR54基因變異和多態(tài)性并不是導致性早熟的常見原因，提示可能存在環(huán)境因素通過表觀遺傳學機制上調KISS-1/GPR54基因的表達，進而刺激GnRH釋放啟動HPGA導致性早熟。

本研究采用動物模型以處于青春啟動前關鍵期的雌性幼鼠(出生21 d)作為研究對象，通過灌胃給予BPA染毒干預，以17β-雌二醇(E2)組作為陽性對照，同時設立溶劑對照組，通過觀察大鼠陰道開口時間(vaginal opening day,VOD，雌性大鼠性早熟的標志)，檢測大鼠卵巢ERα、ERβ mRNA和下丘腦KISS-1、GPR54 mRNA表達和基因甲基化水平。探討B(tài)PA暴露誘導雌性大鼠性早熟的DNA甲基化分子機制，對降低人類BPA暴露危害和女童性早熟等疾病的防治提供科學依據和參考價值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

BPA(分析純99%)，美國Sigma公司，玉米油(溶劑)購于益海嘉里投資有限公司，核酸分離純化試劑盒購于廣州洪祥生物醫(yī)藥科技有限公司，熒光定量PCR反應試劑盒購于日本TaKaRa公司，ERα、ERβ、KISS-1、GPR54引物由上海 Invitrogen 公司合成，DNA Methylation-Gold 試劑盒購于美國ZYMO公司，其他生化試劑及耗材等均購于上海生工生物工程股份有限公司。儀器：Localized Performance超低溫冰箱購于美國Thermo Fisher公司，Eppendorf 5418低溫高速離心機購于德國Eppendorf公司，Millipore-Q A10 超純水儀購于美國Millipore 公司，可見紫外分光光度計購于日本島津公司，PyroMark Q24 焦磷酸測序儀購于美國Qiagen公司，ABI 7900 HT 熒光定量PCR儀購于美國Life Tech公司。

1.2 方法

1.2.1實驗動物模型的建立

經檢疫合格的清潔級1 d齡SD大鼠購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，實驗動物質量合格證明編號：44007200025061，無特定病原體(SPF)級動物房飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室溫度、濕度等條件保持穩(wěn)定，12 h光照和黑暗循環(huán)、自由進食飲水，整個實驗過程均喂以不含大豆異黃酮等植物雌激素的加工飼料，仔鼠于21 d齡斷乳稱重，留取32只雌性幼鼠，分成4組：BPA干預組、BPA空白對照組(以等體積不含BPA的玉米油灌胃處理，并與BPA干預組同時處死)、E2組(17β-estradiol組，E2組，0.1 mg/kg)和溶劑對照組(以等體積不含BPA的玉米油灌胃處理直至大鼠出現陰道開口再處死)，以大鼠皮膚染色和籠具雙重編號標記識別。根據既往研究報道[11-12]，BPA干預濃度設為每天0.25 mg/kg，在人群日常暴露范圍內，每天以灌胃方式持續(xù)給藥10 d，溶劑對照組以相同方式給予等量玉米油。每4天稱重1次，依據體重調整藥物劑量。每天檢查并記錄大鼠陰道開口，并于陰道開口當天處死，處死BPA干預組時按等比例處死BPA空白對照組。留取大鼠下丘腦和卵巢組織置于-80 ℃超低溫冰箱保存待測。本研究由廣東省醫(yī)學實驗動物中心批準，符合動物倫理原則，將實驗大鼠傷害降至最低，無虐待動物行為。

1.2.2卵巢ERα、ERβ mRNA和下丘腦KISS-1、GPR54 mRNA表達水平檢測

分別取出30 mg下丘腦和卵巢組織加入1 mL TRIzol充分研磨，按照RNA提取試劑盒說明書提取下丘腦和卵巢組織總RNA，經紫外光分光光度計檢測核酸純度，將RNA 逆轉錄成cDNA。根據SYBRGreen Real-Time PCR Master Mix試劑盒說明，對下丘腦KISS-1、GPR54和卵巢ERα、ERβ目的基因和管家基因GAPDH分別進行實時PCR(real-time PCR)，real-time PCR反應體系： PCR Master Mix 10 μL,正反向引物各1 μL,去離子水6 μL,cDNA 2 μL,共20 μL。反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 15 s；72 ℃ 30 s，共50個循環(huán)。72 ℃收集熒光，并行基因表達水平分析。各基因引物序列見表1。

表1 目的基因和管家基因引物序列

1.2.3卵巢ERα、ERβ和下丘腦KISS-1、GPR54啟動子區(qū)甲基化水平測定

分別取卵巢和下丘腦組織經充分研磨，按照DNA提取試劑盒說明書分離純化核酸,將提取的DNA置于-20 ℃冰箱內保存?zhèn)溆?。亞硫酸氫鹽轉化和焦磷酸測序PCR：基因組DNA 經過亞硫酸氫鹽處理，序列中未甲基化的胞嘧啶(C)轉變?yōu)槟蜞奏?U)，而甲基化的胞嘧啶保持不變。采用CPGPLOT軟件預測目的基因CpG島區(qū)域，針對上述基因CpG島設計合成特異性引物擴增目的區(qū)段，按儀器和試劑說明書進行單鏈的分離純化和焦磷酸測序。測定目標位點中C/胸腺嘧啶(T)的比率，以此判斷目標位點的甲基化程度。目的基因CpG位點甲基化水平(%)=mC/(mC+T),其中mC表示處于甲基化狀態(tài)的CpG位點測序序列條數，T表示處于非甲基化狀態(tài)的CpG位點測序序列條數。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠VOD和體重比較

BPA干預組和E2組VOD比溶劑對照組顯著提前(P<0.05)，E2組較BPA干預組更早(P<0.05)；第1次給藥前各組大鼠體重相當(P>0.05)，處死時BPA干預組、BPA空白對照組和E2組體重顯著低于溶劑對照組(與生存天數相關，P<0.05)，BPA干預組和BPA空白對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠VOD和體重比較

2.2 各組大鼠卵巢ERα、ERβ和下丘腦KISS-1、GPR54基因mRNA表達情況比較

BPA干預組下丘腦KISS-1、GPR54 mRNA相對表達水平顯著高于BPA空白對照組(P<0.05)，但與溶劑對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。E2組卵巢ERβ和下丘腦KISS-1 mRNA相對表達水平明顯低于溶劑對照組(P<0.05)。E2組和溶劑對照組下丘腦GPR54 mRNA相對表達水平顯著高于BPA空白對照組(處死時尚未出現VOD，P<0.05。見表3。

表3 各組大鼠卵巢ERα、ERβ和下丘腦KISS-1、GPR54基因mRNA相對表達水平比較

2.3 各組大鼠卵巢ERα、ERβ和下丘腦KISS-1、GPR54基因CpG 位點甲基化水平比較

BPA干預組、BPA空白對照組、E2組和溶劑對照組4組間比較，下丘腦KISS-1基因CpG 位點甲基化水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而GPR54基因CpG 位點甲基化水平存在明顯差異，其中BPA干預組、E2組和溶劑對照組GPR54片段1 CpG 位點甲基化水平顯著低于BPA空白對照組(處死時尚未出現VOD，P<0.05)。BPA干預組GPR54片段2 CpG 位點甲基化水平顯著低于溶劑對照組，而E2組卵巢ERβ基因CpG位點甲基化水平顯著高于溶劑對照組(P<0.05)，其余未見統(tǒng)計學差異。見表4。

表4 各組大鼠卵巢ERα、ERβ和下丘腦KISS-1、GPR54基因CpG 位點甲基化水平比較[M(P25,P75)，%，n=8]

2.4 VOD與各目的基因CpG位點甲基化水平的相關性

經秩相關分析，大鼠VOD與GPR54片段1 CpG位點甲基化水平之間呈正相關(r=0.245,P=0.009)，其余目的基因CpG位點甲基化水平與VOD之間未見明顯相關(P>0.05)，見表5。

表5 VOD與各目的基因CpG位點甲基化水平的相關性

3 討 論

個體的生長發(fā)育和性成熟過程受基因、環(huán)境、營養(yǎng)和社會因素等影響[13-14]，近年來，環(huán)境內分泌干擾物(environmental endocrine disrupting chemicals,EDCs)對生殖健康和內分泌干擾作用備受關注。BPA是世界上最高產量的有機化工原料之一，是一種常見且有代表性的EDCs，具有類雌激素樣內分泌干擾作用和生殖毒性。本研究采用玉米油為溶媒，BPA空白對照組采用和BPA干預組等體積的溶媒灌胃處理，同時設立溶劑對照組，旨在最大限度地減少溶媒對實驗結果的影響，保證結論的可信性。研究結果顯示，BPA干預染毒可致處于青春啟動前關鍵期的雌性幼鼠VOD提前，與國內外研究結果一致[11,15-17]，提示青春期前BPA暴露可促進青春期發(fā)育，導致雌性幼鼠性早熟。但是BPA引起性早熟的劑量效應關系有待進一步研究分析。據文獻報道，EDCs存在“U”效應現象，即在一定的劑量范圍內，劑量-效應曲線的斜率可發(fā)生正負轉換[18]。

近年來，隨著表觀遺傳學機制研究的顯著進展，DNA甲基化分子機制在“青春發(fā)育啟動”這個兼有短期快速和長期緩慢調節(jié)特點的復雜生理現象中的調控作用備受關注[19-20]。EDCs等環(huán)境因素直接改變靶基因序列并不常見，而是主要通過改變靶基因啟動子區(qū)DNA甲基化、組蛋白修飾和微RNA(micro RNA)介導等表觀遺傳學機制調控其轉錄和表達，啟動子區(qū)DNA高甲基化能抑制轉錄因子與其結合，導致基因表達抑制或沉默，從而發(fā)揮其毒性和干擾作用。動物研究表明，GnRH、ESR1等HPGA相關基因啟動子區(qū)甲基化水平改變可能導致青春發(fā)育啟動時間提前[21]；新生小鼠BPA暴露可能通過改變細胞信號通路重要基因甲基化水平，導致成年后前列腺癌的患病風險增加；BPA暴露水平與不孕癥婦女外周血DNA甲基化水平相關[22]。動物和人體研究均表明下丘腦KISS-1/GPR54基因系統(tǒng)是HPGA激活和青春期啟動的關鍵環(huán)節(jié)，是GnRH神經元和HPGA的重要調控基因。本研究結果顯示，GPR54 mRNA表達和基因片段1 CpG位點甲基化水平在大鼠VOD出現與否組別間存在顯著差異，即進入青春期大鼠下丘腦GPR54 mRNA表達和基因片段1 CpG位點甲基化水平較青春期前發(fā)生顯著改變。且其甲基化水平與大鼠VOD之間存在正相關，推測GPR54基因片段1 CpG甲基化改變與大鼠青春期啟動有關。另外，BPA干預組GPR54片段2 CpG甲基化水平顯著低于溶劑對照組，且其 mRNA表達水平顯著高于BPA空白對照組，提示GPR54片段2 CpG位點甲基化水平降低和mRNA表達增加，可能是BPA暴露誘導雌性大鼠性早熟的表觀遺傳調控機制之一。

本研究發(fā)現，BPA干預組KISS-1 mRNA表達水平顯著高于空白對照組，但KISS-1基因CpG位點甲基化水平在4組(BPA干預組、BPA空白對照、E2組和溶劑對照組)間差異并無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，這可能與KISS-1基因上游調控因子的轉錄抑制有關。LOMNICZI等[23]對雌鼠青春發(fā)育啟動機制研究結果證實，大鼠下丘腦PcG蛋白是KISS-1基因的轉錄抑制因子和主要抑制蛋白。大鼠在青春期啟動關鍵期，下丘腦PcG蛋白關鍵基因甲基化增強導致PcG蛋白表達下降，對KISS-1基因的轉錄抑制減少，引起KISS-1基因表達增強從而激活青春期的啟動。如果PcG蛋白關鍵基因啟動子的甲基化被抑制，大鼠則無法進入青春期發(fā)育。因此，推測BPA可能通過DNA甲基化機制作用于大鼠下丘腦PcG蛋白關鍵基因啟動子區(qū)CpG位點，導致PcG蛋白關鍵基因抑制或沉默，繼而PcG蛋白阻斷轉錄活化因子與KISS-1基因啟動子區(qū)結合的功能下調，PcG蛋白抑制KISS-1基因轉錄作用減弱，從而使得KISS-1基因轉錄增強。也即，BPA暴露誘導雌性大鼠性早熟的表觀遺傳學機制，并不是直接通過改變KISS-1基因CpG位點甲基化實現，提示青春期啟動涉及興奮和抑制雙向有序調節(jié)的多基因功能網絡系統(tǒng)，其明確機制有待進一步實驗研究和驗證。

本研究將E2干預組作為大鼠VOD提前的陽性對照[24]。結果顯示，E2組VOD提前較BPA干預組更早，E2干預組大鼠卵巢ERβ基因mRNA表達和CpG位點甲基化水平均與溶劑對照組間存在顯著差異，且E2下丘腦KISS-1 mRNA表達水平明顯低于溶劑對照組。表明E2暴露可通過改變ERβ基因CpG位點甲基化水平，從而下調卵巢ERβ基因mRNA表達水平。卵巢ERα作用以引起卵泡細胞增殖為主，而ERβ則是卵巢組織中雌激素發(fā)揮作用的重要受體和途徑[25]。推測雌性幼鼠給予高濃度E2干預，一方面可通過ERβ基因CpG位點甲基化機制下調ERβ表達水平，另一方面可能導致下丘腦 KISS-1 基因神經元應對性激素正反饋通路破壞導致KISS-1 mRNA表達水平下降，最終干擾和破壞HPGA的正常功能。

綜上所述，本研究初步探討了BPA暴露誘導雌性大鼠性早熟的下丘腦KISS-1和GPR54基因甲基化分子機制，提示下丘腦GPR54基因甲基化水平改變可能是BPA生殖毒性機制之一。筆者期待DNA甲基化和組蛋白修飾結合特定細胞群分離術等先進技術，以表觀遺傳學發(fā)病機制為突破口，揭示BPA等內分泌干擾素與內分泌疾病和性發(fā)育異常的關系，以指導人類更好地應對內分泌干擾素暴露和相關疾病的防治。