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    重癥手足口病患兒T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞及細(xì)胞因子水平變化

    2021-11-03 06:14:54馮曉靖黃振紅
    傳染病信息 2021年5期
    關(guān)鍵詞:輕癥亞群口病

    岳 瑾,馮曉靖,黃振紅,王 芳

    手足口病是由EV感染所致的一種傳染性疾病,在我國發(fā)病率呈逐年上升趨勢,是全球性公共衛(wèi)生問題之一。該病常見于嬰幼兒,大多數(shù)患者癥狀較輕,表現(xiàn)為口腔、手、足等部位出現(xiàn)斑丘疹、皰疹,可伴有發(fā)熱,預(yù)后良好[1]。個(gè)別患者可發(fā)展為重癥,常累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng),發(fā)生心肌炎、急性遲緩性癱瘓、無菌腦膜炎、腦干腦炎等疾病,甚至引起死亡。已知自然界中有20多種EV可導(dǎo)致手足口病,其中Cox A組和B組、埃可病毒、EV 71型最為常見,由于該病病原學(xué)組成持續(xù)變化,流行毒株也在改變,因此持續(xù)監(jiān)測病原感染趨勢十分必要[2-3]。研究表明,分析患者免疫系統(tǒng)指標(biāo)、血清炎癥細(xì)胞因子水平,有助于判斷患者機(jī)體免疫狀況、病情進(jìn)展等[4-5]。為此,本研究對我院收治的手足口病患兒的外周血T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞及細(xì)胞因子水平變化進(jìn)行分析,現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 對象與方法

    1.1 對象 將2018年1月—2020年4月在鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院治療的97例手足口病患兒納入研究。納入標(biāo)準(zhǔn):①符合原中國衛(wèi)生部發(fā)布的《手足口病診療指南(2013年版)》[6](指南)中手足口病的診斷標(biāo)準(zhǔn);②年齡1~12歲;③在我院采用相同治療方案;④家屬簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)[7-8]:①合并其他感染;②6個(gè)月內(nèi)患有其他傳染?。虎?個(gè)月內(nèi)發(fā)生呼吸道感染;④患有其他EV感染性疾??;⑤合并內(nèi)分泌系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)疾病。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

    參照指南[6]中疾病嚴(yán)重程度的判定標(biāo)準(zhǔn),將患兒分為重癥組(25例)和輕癥組(72例)。重癥組中男13例,女12例,平均(3.97±0.29)歲;輕癥組中男39例,女33例,平均(4.02±0.31)歲。納入同期50例健康體檢兒童為對照組,其中男27例,女23例,平均(3.94±0.23)歲。3組間上述資料比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

    根據(jù)感染病毒種類不同,將重癥組患兒分為:Cox A16組(13例)、EV 71組(8例)、其他組(4例)。Cox A16組男7例,女6例,平均(3.93±0.54)歲;EV 71組,男4例,女4例,平均(3.99±0.38)歲;其他組,男2例,女2例,平均(4.01±0.21)歲;3組間上述資料比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

    根據(jù)指南[6]將重癥組患兒分為急性期組(6例)和恢復(fù)期組(19例)。急性期組男3例,女3例,平均(4.01±0.22)歲;恢復(fù)期組男10例,女9例,平均(3.89±0.27)歲;2組間上述資料比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

    根據(jù)不同預(yù)后結(jié)局,將重癥組患兒分為預(yù)后不良組(5例)和預(yù)后良好組(20例)。預(yù)后不良組男3例,女2例,平均(3.95±0.49)歲;預(yù)后良好組男10例,女10例,平均(3.99±0.21)歲;2組間上述資料比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

    1.2 方法

    1.2.1 NK細(xì)胞檢測 患兒入院 24 h內(nèi)抽取2 ml肘靜脈全血,置于EDTA-K2抗凝管內(nèi),取100 μl抗凝處理后的全血垂直加入計(jì)數(shù)管底部,分別加CD56、CD45、CD16、CD3四色熒光標(biāo)記抗體,均為20 μl,混勻后在室溫避光孵育15 min,向其中加500 μl溶血素,震蕩混合均勻后在室溫下避光孵育10~15 min,每管均加PBS 500 μl,震蕩混合均勻并上機(jī)檢測。以CD45+、CD3-設(shè)門,以CD56為縱坐標(biāo),CD16為橫坐標(biāo),檢測NK細(xì)胞即CD3-CD16+CD56+百分率。T淋巴細(xì)胞亞群檢測:另取100 μl抗凝處理的全血,垂直加至計(jì)數(shù)管底,加CD8、CD4、CD3三色熒光標(biāo)記抗體,均為 20 μl,混合均勻后在室溫條件下避光孵育15 min,加500 μl溶血素混合均勻,繼續(xù)室溫避光孵育10~15 min,每管加PBS 500 μl,混勻上機(jī)檢測,CD3+和光散射設(shè)門,CD8為縱坐標(biāo),CD4為橫坐標(biāo),檢測CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞百分率。

    1.2.2 T淋巴細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子檢測 使用美國BD公司提供的FACS Calibur流式細(xì)胞儀;Simulset軟件分析結(jié)果;使用美國BD公司生產(chǎn)的CD8+PE、CD4+FITC和CD3+PerCP三色抗體和CD(16+56)抗體。使用酶聯(lián)免疫法檢測外周血TNF-α、IL-23、IL-22、IL-17水平,均按試劑盒(南京奧尼多福公司)說明書進(jìn)行。免疫學(xué)指標(biāo)和細(xì)胞因子檢測由同一組檢驗(yàn)科醫(yī)師完成操作。

    1.3 觀察指標(biāo) 對比T淋巴細(xì)胞亞群(CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞)、NK細(xì)胞及細(xì)胞因子(TNF-α、IL-23、IL-22、IL-17)水平在對照組、輕癥組、重癥組間的差異,在重癥組不同類型病毒感染組(Cox A16組、EV 71組、其他組)間的差異,以及重癥組中急性期組與恢復(fù)期組間的差異,預(yù)后不良組和預(yù)后良好組間的差異。

    1.4 療效評(píng)估 體溫正常,精神良好,無肢體抖動(dòng)、皮疹,皰疹結(jié)痂無液體滲出為顯效;體溫<37.5 ℃,神經(jīng)系統(tǒng)癥狀好轉(zhuǎn),無驚跳、嘔吐發(fā)生,大部分皰疹干燥結(jié)痂,少數(shù)有液體滲出為好轉(zhuǎn);以上均為預(yù)后良好。皰疹、體溫、精神狀態(tài)無明顯改善或死亡,均為預(yù)后不良。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P=0.05(雙側(cè))為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性界值。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以x±s表示,3組間比較采用F檢驗(yàn),2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以百分率(%)表示,比較采用χ2檢驗(yàn)。經(jīng)ROC曲線檢測4項(xiàng)細(xì)胞因子預(yù)測不良預(yù)后效能。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 對照組、輕癥組、重癥組T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞及細(xì)胞因子水平對比 CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、NK細(xì)胞水平從高到低均依次為對照組、輕癥組、重癥組;CD8+T細(xì)胞水平從低到高依次為對照組、輕癥組、重癥組,組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。血清TNF-α、IL-23、IL-22、IL-17水平從低到高均依次為對照組、輕癥組、重癥組,組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表1。

    表1 對照組、輕癥組、重癥組T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞、細(xì)胞因子水平比較Table 1 Comparison of T lymphocyte subsets, NK cells and cytokines levels in control group, mild group and severe group

    2.2 不同類型病毒感染組T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞、細(xì)胞因子水平對比 Cox A16組、EV 71組、其他組之間T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞、細(xì)胞因子水平比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

    表2 不同類型病毒感染組T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞、細(xì)胞因子水平比較Table 2 Comparison of T lymphocyte subsets, NK cells and cytokines levels in different infection type groups

    2.3 急性期組與恢復(fù)期組T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞、細(xì)胞因子水平比較 與恢復(fù)期組相比,急性期組患兒CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、NK細(xì)胞水平更低,CD8+T細(xì)胞、TNF-α、IL-23、IL-22、IL-17水平更高,組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表3。

    表3 急性期組與恢復(fù)期組T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞、細(xì)胞因子水平比較Table 3 Comparison of T lymphocyte subsets, NK cells and cytokines levels between acute phase group and recovery phase group

    2.4 不同預(yù)后組T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞、細(xì)胞因子水平比較 與預(yù)后良好組相比,預(yù)后不良組CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、NK細(xì)胞水平更低,CD8+T細(xì)胞、TNF-α、IL-23、IL-22、IL-17水平更高,組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表4。

    表4 不同預(yù)后組T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞、細(xì)胞因子水平比較Table 4 Comparison of T lymphocyte subsets, NK cells and cytokines levels in different prognosis outcomes

    2.5 細(xì)胞因子預(yù)測預(yù)后不良ROC分析 4項(xiàng)細(xì)胞因子聯(lián)合預(yù)測患兒不良預(yù)后敏感度為83.33%,準(zhǔn)確度為71.43%。見表5。

    表5 細(xì)胞因子預(yù)測不良預(yù)后ROC分析Table 5 ROC analysis of cytokines in predicting poor prognosis

    3 討 論

    T淋巴細(xì)胞具有誘導(dǎo)或輔助免疫應(yīng)答、抑制免疫應(yīng)答及殺傷靶細(xì)胞功能,介導(dǎo)局部炎癥反應(yīng)、細(xì)胞免疫,并將細(xì)胞中病原體清除。CD3+T細(xì)胞是外周血成熟T細(xì)胞的最佳標(biāo)志物之一,可用于免疫缺陷、T淋巴細(xì)胞型淋巴瘤、白血病等分析[10]。CD4+T細(xì)胞作為人體免疫系統(tǒng)指揮中樞,負(fù)責(zé)控制和消滅多種感染,對抗入侵病菌,常用于白血病、淋巴瘤的免疫分型診斷,能評(píng)價(jià)機(jī)體免疫功能和免疫抑制療法效果[11]。CD8+T細(xì)胞是抑制性和殺傷性T淋巴細(xì)胞以及遲發(fā)超敏反應(yīng)T細(xì)胞的共同標(biāo)記,對某些腫瘤細(xì)胞、病毒等抗原物質(zhì)有殺傷作用,是機(jī)體抗腫瘤、抗病毒免疫防線的重要組成[12]。本研究中,輕癥組和重癥組患兒外周血CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞水平均較對照組低,重癥組患兒較輕癥組更低;3組CD8+T細(xì)胞水平比較,對照組最低,其次為輕癥組,重癥組最高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。既往研究指出重癥手足口病患兒外周血CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞水平顯著下降[13],與本研究結(jié)果基本一致。

    CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞分化形成抗體,可控制和消滅多種感染,對抗病菌入侵,阻止疾病發(fā)作和加重;CD8+T細(xì)胞抑制抗體合成和分泌;CD4/CD8比值互相制約,達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡,但CD4/CD8比值失衡提示免疫功能紊亂,CD4+T細(xì)胞降低而CD8+T細(xì)胞升高提示機(jī)體抗病免疫力不足。相對于健康兒童,手足口病患兒細(xì)胞免疫功能受損,機(jī)體出現(xiàn)免疫抑制狀態(tài),導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞水平大幅下降,CD8+T細(xì)胞水平升高。上述指標(biāo)在重癥組與輕癥組、預(yù)后良好組和預(yù)后不良組間比較,輕癥組患兒機(jī)體細(xì)胞免疫功能受損較輕,機(jī)體免疫功能關(guān)系預(yù)后,但機(jī)體免疫紊亂嚴(yán)重時(shí)往往提示患兒抗凝能力差,提示預(yù)后不良,故重癥組和預(yù)后不良組患兒均呈現(xiàn)更顯著的CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞水平下降和CD8+T細(xì)胞水平升高。與急性期組相比,恢復(fù)期組患兒細(xì)胞免疫功能正在逐漸恢復(fù),機(jī)體免疫應(yīng)激狀態(tài)逐漸解除,因此CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞水平較急性期更高,CD8+T細(xì)胞水平較急性期更低。上述研究結(jié)果說明病情更重、預(yù)后不佳的患兒細(xì)胞免疫功能紊亂越明顯;考慮手足口病主要病原體為EV 71型和Cox A16型,EV感染導(dǎo)致患兒腸道微生物群生態(tài)失調(diào)和丁酸鹽生成細(xì)菌減少,致病菌增多,損傷腸道生物黏膜屏障及住宿免疫,導(dǎo)致免疫功能紊亂;此外,患兒機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈免疫反應(yīng),促進(jìn)疾病恢復(fù)同時(shí)導(dǎo)致免疫損傷。

    NK細(xì)胞是重要免疫細(xì)胞,是天然免疫系統(tǒng)核心細(xì)胞,分布在肝臟、外周血、脾臟中,負(fù)責(zé)殺傷受病毒感染的細(xì)胞、老化細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等異常細(xì)胞[14-15]。本研究中NK細(xì)胞水平從高到低依次為對照組、輕癥組、重癥組;重癥患兒中急性期組NK細(xì)胞較恢復(fù)期組低;預(yù)后不良組NK水平較預(yù)后良好組低(P均<0.05)。提示NK細(xì)胞低水平患兒病情重、預(yù)后差??紤]是因?yàn)镹K細(xì)胞能繞過TCR/CD3識(shí)別途徑,以主要組織相容性復(fù)合體非限制形式快速識(shí)別并殺滅侵入人體的病毒,同時(shí)分泌IFN-γ等細(xì)胞因子,上調(diào)吞噬細(xì)胞吞噬功能,從而阻止病情進(jìn)展,改善預(yù)后。

    TNF-α、IL-23、IL-22、IL-17 是反映機(jī)體炎性狀態(tài),指導(dǎo)病情評(píng)估和治療的重要指標(biāo)[16]。手足口病為感染性疾病,發(fā)病后機(jī)體會(huì)釋放大量致炎因子,導(dǎo)致血 TNF-α、IL-23、IL-22、IL-17水平升高[17-18]。故本研究中輕癥組上述指標(biāo)均高于對照組,重癥組高于輕癥組(P均<0.05)。病情重,急性期和預(yù)后不良的患兒往往機(jī)體炎癥反應(yīng)更顯著,輕癥患兒炎癥反應(yīng)較輕,因此以手、足、口等紅暈和皰疹為特征,免疫功能紊亂較輕,免疫指標(biāo)異常較輕,預(yù)后良好;重癥患兒炎癥反應(yīng)強(qiáng),細(xì)胞免疫功能失衡較重,因此T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、炎癥相關(guān)細(xì)胞因子異常更明顯,表現(xiàn)為腦膜炎、心肌炎等癥狀,預(yù)后相對較差[19-20]。這也是預(yù)后不良組TNF-α、IL-23、IL-22、IL-17水平更高(P<0.05)的重要原因。但上述單項(xiàng)細(xì)胞因子指標(biāo)用于預(yù)測患兒不良預(yù)后,敏感度和準(zhǔn)確度低,意義不大。本研究中ROC曲線分析顯示,4項(xiàng)細(xì)胞因子聯(lián)合預(yù)測患兒不良預(yù)后的敏感度為83.33%,準(zhǔn)確度為71.43%,提示聯(lián)合應(yīng)用可提高預(yù)測患兒不良預(yù)后的效能。

    綜上所述,重癥手足口病患兒外周血T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞及細(xì)胞因子水平顯著異常,患兒存在免疫紊亂、明顯炎癥反應(yīng),檢測上述指標(biāo)利于病情和預(yù)后判斷,指導(dǎo)診斷治療;此外上述檢查方便快捷,創(chuàng)傷性小,短期可重復(fù)性強(qiáng);但單獨(dú)使用其中一種指標(biāo)敏感度、準(zhǔn)確性低,須要聯(lián)合上述各項(xiàng)指標(biāo)以及其他方法進(jìn)行觀察。

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