Netrin1在顳葉癲癇大鼠再認記憶中的作用及機制

劉文萍，劉麗丹，徐佳駿，李達麗，彭顏暉

癲癇是大腦神經(jīng)元反復(fù)、異常、同步放電所致的神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]，其病程較長，部分患者會產(chǎn)生耐藥而發(fā)展為難治性癲癇[2]。癲癇發(fā)生機制復(fù)雜，免疫異常、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、離子通道異常、遺傳、顱腦損傷、先天及圍產(chǎn)期異常、腫瘤、腦血管病、寄生蟲病等都是可能致病因素[3,4]。顳葉癲癇是最常見的難治性癲癇，常伴發(fā)再認記憶障礙，以及焦慮、抑郁等精神癥狀[5]。再認記憶是指對既往發(fā)生過的人物、事件的再回想與記憶的認知過程。Netrin家族是最早發(fā)現(xiàn)的可溶性軸突導(dǎo)向分子，由一類結(jié)構(gòu)上高度保守且與層粘連蛋白相關(guān)的可分泌蛋白組成[6]。以Netrin1為代表的Netrin家族通過DCC受體家族與UNC-5受體家族結(jié)合，具有傳遞化學(xué)吸引、排斥作用，在神經(jīng)傳導(dǎo)通路構(gòu)建及神經(jīng)細胞遷移過程中產(chǎn)生導(dǎo)向作用[7]。本研究探討Netrin1在顳葉癲癇大鼠再認記憶中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

成年雄性Sprague-Dawley大鼠48只，體質(zhì)量180～200 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供；動物飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動物房，自由飲食水，規(guī)律光照。氯化鋰購自成都曼思特科技有限公司；Netrin1單克隆抗體購于Abcam公司；qPCR試劑盒購于湖南諾科生物有限公司；Netrin1探針合成由大連TAKARA公司完成。實驗步驟經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)大學(xué)倫理委員會同意，且遵守動物實驗的相關(guān)國際公約。

1.2 方法

1.2.1 造模 大鼠隨機分為對照組與模型組，每組24只。模型組：腹腔注射氯化鋰生理鹽水（125 mg/kg），18 h后腹腔注射硫酸阿托品（1 mg/kg）降低毒副反應(yīng)，再腹腔注射匹羅卡品（20 mg/kg）。將發(fā)作程度達Racine評分Ⅳ～Ⅴ級、癲癇狀態(tài)持續(xù)＞30 min者納入后續(xù)研究。經(jīng)4～7 d靜止期后出現(xiàn)自發(fā)性反復(fù)癲癇發(fā)作者判定為致癇成功。未成功致癇的大鼠剔除，補足入組大鼠至24只。對照組注射給予等劑量的生理鹽水，余處理同模型組大鼠。癲癇分級標(biāo)準(zhǔn)（Racine評分）：無任何反應(yīng)為0級；面部陣攣，包括眨眼、動須、節(jié)奏性咀嚼等為Ⅰ級；Ⅰ級加節(jié)律性點頭為Ⅱ級；Ⅱ級加前肢肌陣攣，但無后肢直立位為Ⅲ級；Ⅲ級加后肢直立位為Ⅳ級；全面性強直-陣攣發(fā)作，并失去體位控制為Ⅴ級。

1.2.2 觀察指標(biāo) ①空間學(xué)習(xí)記憶功能評估：致癇成功后1、7、15 d，采用Morris水迷宮實驗進行評估，記錄每只大鼠的逃避潛伏期（大鼠自入水至找到水下救生平臺所用的時間）；②致癇成功后1、7、15 d，取各組大鼠的海馬組織，每個時間點取8只大鼠，熒光定量PCR檢測Netrin1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平，Western blot檢測Netrin1蛋白表達水平（每種取4只大鼠）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布以及方差齊性的計量資料以（±s）表示，t檢驗或方差分析；計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 水迷宮逃避潛伏期比較

造模后1、7、15 d，模型組水迷宮逃避潛伏期均長于對照組（均P＜0.05），但組內(nèi)差別無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

表1 2組水迷宮逃避潛伏期比較（s,±s）

表1 2組水迷宮逃避潛伏期比較（s,±s）

注：與對照組比較，①P<0.05

組別對照組模型組只數(shù)4 4 1 d 17.2±4.8 55.3±4.8①7 d 16.8±3.8 54.0±8.3①15 d 17.1±4.1 53.9±4.6①

2.2 Netrin1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平比較

造模后1、7、15 d，模型組海馬Netrin1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平均高于對照組（均P＜0.05），見表2。

表2 2組Netrin1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平比較（±s）

表2 2組Netrin1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平比較（±s）

注：與對照組比較，①P<0.05

組別只數(shù)Netrin1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平1 d 7 d 15 d對照組模型組4 4 0.67±0.13 2.31±0.05①0.56±0.05 2.09±0.10①0.62±0.11 2.23±0.21①組別對照組模型組Netrin1蛋白表達水平1 d 0.63±0.08 2.14±0.010①7 d 0.58±0.04 2.00±0.11①15 d 0.63±0.10 2.26±0.09①

3 討論

再認記憶是記憶過程中的典型模式，再認記憶的形成結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)包括視覺傳導(dǎo)路、顳葉內(nèi)側(cè)結(jié)構(gòu)、額葉和頂葉皮質(zhì)。再認記憶的形成是腦網(wǎng)絡(luò)不斷激活的產(chǎn)物。Morris水迷宮是用來檢測海馬依賴的空間學(xué)習(xí)記憶能力的經(jīng)典方法[8]。本研究顯示模型組致癇后1、7、15 d的水迷宮實驗逃避潛伏期都顯著高于對照組，表明癲癇可伴隨有再認記憶障礙。

血腦屏障的破壞可能是癲癇發(fā)生再認記憶障礙的機制之一。血腦屏障破壞后，大鼠癲癇發(fā)作閾降低；而血腦屏障內(nèi)皮細胞中的Netrin1可能與血腦屏障的滲透性有關(guān)。Netrin1不僅是軸突導(dǎo)向分子，它還能調(diào)節(jié)細胞遷移，影響細胞與細胞之間，細胞與基質(zhì)之間的粘附[9]。Netrin1也能夠促進內(nèi)皮細胞增殖，血管的分支過程和血管密度的增加，改善缺血狀況的病理學(xué)癥狀[10]。在體外實驗中，人腦源性的內(nèi)皮細胞用Netrin1處理或與星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)，脂筏膜微區(qū)里的連接蛋白表達增加。連接蛋白相互作用，形成維持屏障完整性的功能簇。在體內(nèi)，Netrin1基因敲除鼠也出現(xiàn)了緊密連接蛋白表達的紊亂和血腦屏障的破壞。因此，Netrin1是一個重要的血腦屏障維持因子[11]。本研究顯示模型組海馬Netrin1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平都顯著高于對照組。推測Netrin1 mRNA在致癇大鼠海馬的高表達，可能是機體的自我修復(fù)反應(yīng)，也有可能與癲癇導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)有關(guān)[12]。

綜上所述，氯化鋰-匹羅卡品可成功建立大鼠癲癇模型，癲癇大鼠出現(xiàn)再認記憶障礙，同時其海馬組織的Netrin1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平增高，其具體機制尚需進一步研究。