基于Wolff-Kishner-黃鳴龍法合成紅火蟻告警信息素及其觸角電位反應(yīng)

王麗坤，黃 俊，章金明，李曉維，張治軍，MUHAMMAD Hafeez，呂要斌，*

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 a.農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(籌)，浙江 杭州 310021； b.植物保護(hù)與微生物研究所，浙江省植物有害生物防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室——省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 杭州 310021)

紅火蟻(SolenopsisinvictaBuren)是一種重要的農(nóng)林業(yè)害蟲，也是世界自然保護(hù)聯(lián)盟(International Union for Conservation of Nature，IUCN)收錄的最具有破壞力的入侵生物之一[1]，目前已經(jīng)入侵我國(guó)15個(gè)省份，造成嚴(yán)重危害。紅火蟻不僅入侵能力強(qiáng)，擴(kuò)散速度快，而且能對(duì)人畜造成極其嚴(yán)重的危害[2-4]。作為典型的社會(huì)性昆蟲，紅火蟻具有明顯的等級(jí)分化和個(gè)體分工。一個(gè)成熟的紅火蟻蟻巢由幾萬(wàn)至幾十萬(wàn)頭大小工蟻、幾百頭有翅雌蟻和有翅雄蟻、1頭或多頭蟻后及未成年的個(gè)體(卵、幼蟲與蛹)組成[5]，目前我國(guó)發(fā)現(xiàn)入侵紅火蟻種群基本上為多蟻后型。紅火蟻不同品級(jí)之間之所以能夠保持高度有序的分工和分配，主要依靠相關(guān)腺體分泌的信息素物質(zhì)，如杜氏腺(Dufour’s gland)產(chǎn)生跟蹤信息素(trail pheromone)、下頜腺(mandibular gland)產(chǎn)生告警信息素(alarm pheromone)等[6-7]。

告警信息素指由昆蟲釋放并能引起同種個(gè)體釆取防御行為的化學(xué)物質(zhì)，是社會(huì)性昆蟲一項(xiàng)重要的信息素物質(zhì)。紅火蟻告警信息素的主要成分為2-乙基-3，6-二甲基吡嗪，該化合物能夠引起紅火蟻強(qiáng)烈的告警反應(yīng)。研究表明，工蟻、雌蟻、雄蟻和蟻后均能產(chǎn)生告警信息素，在婚飛過程中，雄蟻、雌蟻告警信息素的含量也發(fā)生顯著變化，因此，推測(cè)該化合物很可能參與紅火蟻婚飛等過程[8-9]。此外，告警信息素還對(duì)紅火蟻的重要天敵——寄生性蚤蠅有強(qiáng)烈的引誘作用[10-11]。然而，由于紅火蟻告警信息素在昆蟲體內(nèi)含量極低，腺體成分復(fù)雜，難以直接分離純化，且商品化的標(biāo)準(zhǔn)品為2-乙基-3，6-二甲基吡嗪(40%)和2-乙基-3，5-二甲基吡嗪(60%)的混合物[12-14]，因此極大地限制了紅火蟻告警信息素的發(fā)展和應(yīng)用。

Wolff-Kishner-黃鳴龍還原法是一個(gè)重要的有機(jī)反應(yīng)，它是將羰基還原成為亞甲基的常用方法之一[15]，因此，本文基于該合成方法，通過一步反應(yīng)獲得2-乙基-3，6-二甲基吡嗪，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)合成化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，并通過觸角電位儀(EAG)測(cè)定紅火蟻工蟻對(duì)不同濃度2-乙基-3，6-二甲基吡嗪的反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 供試紅火蟻

紅火蟻采集于浙江省永康市新樓村(東經(jīng)120°22′28″，北緯28°85′71″)，將整個(gè)蟻巢挖回，室內(nèi)經(jīng)水滴法分離得到紅火蟻，利用黃粉蟲(Tenebriomolitor)飼養(yǎng)，每個(gè)蟻群每天飼喂3～4頭黃粉蟲。紅火蟻采集、分離和飼養(yǎng)方法參照呂利華等[16]和孫延勇等[17]的方法。

1.2 供試試劑

1-(3，6-二甲基吡嗪-2-基)乙酮(95%)、水合肼(85%)和二聚乙二醇(AR)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(SCR?，上海)，氫氧化鉀購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司，2-乙基-3，5(6)-二甲基吡嗪(分析標(biāo)準(zhǔn)品，異構(gòu)體混合物，純度99%)購(gòu)自阿拉丁生化科技股份有限公司(Aladdin?，上海)，其他所需試劑均購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司(Sigma-Aldrich)，其中，乙酸乙酯為分析純(AR)，正己烷為色譜純(HPLC， 99%)。

1.3 紅火蟻告警信息素合成

將1-(3，6-二甲基吡嗪-2-基)乙酮(180.1 mg，1.2 mmol·L-1)加入到溶有85%水合肼(357.2 mg，6 mmol·L-1)的二聚乙二醇(30 mL)溶液中，緩慢升溫至150 ℃反應(yīng)2 h，冷卻至室溫后加入氫氧化鉀(269.3 mg，4.8 mmol·L-1)，逐漸加熱至180 ℃，再回流反應(yīng)4 h。薄層色譜(TLC)檢測(cè)反應(yīng)完全后，將反應(yīng)體系冷卻至室溫，加入30 mL水。用乙酸乙酯萃取(20 mL×3)，合并有機(jī)相后經(jīng)無水硫酸鎂干燥、過濾和旋蒸后得到粗品，再經(jīng)柱層析色譜(乙酸乙酯∶石油醚1∶20)分離得到淡黃色產(chǎn)物，收率為85%，經(jīng)GC-MS和市售標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。反應(yīng)路線如圖2所示。

1.4 GC-MS分析

將化合物用正己烷(99%，色譜級(jí))溶解，經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS，SHIMADZU GC-MS-QP2010 Plus)對(duì)化合物進(jìn)行分析。色譜柱Rxi-5ms(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；升溫程序：起始溫度50 ℃，10 ℃·min-1至150 ℃，25 ℃·min-1至250 ℃，保持5 min；進(jìn)樣量1 μL，不分流；載氣為He(>99.999%)；離子源為EI，離子源溫度200 ℃，進(jìn)樣口溫度250 ℃；電子能量70 eV；掃描質(zhì)量范圍40～500m/z。

1.5 觸角電位反應(yīng)(EAG)

EAG測(cè)定方法參照Guan等[18]和Li等[19]。用手術(shù)刀切下紅火蟻工蟻頭部，切口端與充滿Ringer’s電生理鹽水的參比電極相連，觸角的尖端連接記錄電極。電極通過銀-氯化銀絲與信號(hào)放大器連接，信號(hào)通過探針檢測(cè)(INR-II， Syntech?， the Netherlands)，利用EAG2000軟件(Syntech?，the Netherlands)記錄和分析數(shù)據(jù)。取10 μL待測(cè)樣品，均勻涂抹在濾紙條上，放入巴斯德管中，平衡30 s后用于刺激紅火蟻，觀察電位的變化。為了保證所有的待測(cè)紅火蟻工蟻在測(cè)試過程中的活性與數(shù)據(jù)的有效性，實(shí)驗(yàn)溶劑正己烷作空白對(duì)照，分別比較合成的告警信息素與市售的2-乙基-3，5(6)-二甲基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)樣品的觸角電位反應(yīng)，在待測(cè)樣品測(cè)試之前和結(jié)束之后兩個(gè)對(duì)照各測(cè)試一次，取平均結(jié)果。若測(cè)試之前，陽(yáng)性樣品反應(yīng)過小，則另挑選強(qiáng)壯的工蟻測(cè)試。測(cè)試過程中，兩種化合物各設(shè)置5個(gè)濃度，分別為0.001、0.01、0.1、1和10 mg·mL-1，每個(gè)濃度重復(fù)5次。測(cè)試時(shí)間頻率是0.2 s，空氣的流速為800～1 000 mL·min-1。為確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，第2次刺激與第1次刺激之間需要間隔1 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅火蟻告警信息素合成

通過Wolff-Kishner-黃鳴龍還原法，將1-(3，6-二甲基吡嗪-2-基)乙酮在強(qiáng)堿作用下還原成2-乙基-3，6-二甲基吡嗪，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)GC-MS和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)比分析。從總離子流色譜圖(TIC)可以看出(圖3)，市售標(biāo)準(zhǔn)品有兩個(gè)明顯的峰，根據(jù)文獻(xiàn)[20-21]和標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)品信息可以確定保留時(shí)間6.28 min的化合物1為2-乙基-3，6-二甲基吡嗪，6.38min的化合物2為2-乙基-3，5-二甲基吡嗪。在相同色譜條件下對(duì)合成化合物進(jìn)行GC-MS分析，在TIC圖譜中合成化合物的保留時(shí)間為6.27 min，與標(biāo)準(zhǔn)品中化合物1相對(duì)應(yīng)；進(jìn)一步對(duì)合成化合物的分子離子峰及其碎片信息進(jìn)行分析，分子量m/z135的碎片豐度為100%，因此可以判斷出該峰為準(zhǔn)分子離子峰，主要由分子失氫裂解形成，即[M-H]+峰；由準(zhǔn)分子離子進(jìn)一步裂解，通過失去CH3、CHN、CH3CN和CH3CH2CN后分別得到m/z 121、108、94、80的碎片(圖4)。進(jìn)一步利用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)合成化合物1進(jìn)行定量分析，化合物1的純度為90.2%。

2.2 合成紅火蟻告警信息素 EAG分析

EAG實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，標(biāo)準(zhǔn)品和合成化合物均能引起工蟻強(qiáng)烈的觸角電位反應(yīng)，隨著濃度的增加紅火蟻工蟻觸角對(duì)化合物的反應(yīng)逐漸增強(qiáng)，當(dāng)劑量達(dá)到200 μg時(shí)反應(yīng)最強(qiáng)。劑量為0.01、0.1、1、10和200 μg時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品和合成化合物之間沒有顯著差異(P>0.05)。然而，當(dāng)樣品劑量為100 μg時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品和合成化合物之間差異顯著(P<0.05)。

3 討論

Wolff-Kishner-黃鳴龍還原反應(yīng)是有機(jī)化學(xué)中經(jīng)典的有機(jī)人名反應(yīng)之一，該方法是第一個(gè)以華人命名的有機(jī)化學(xué)反應(yīng)[15]。本研究通過設(shè)計(jì)和相關(guān)檢索，首次利用該還原法合成紅火蟻告警信息素。在水合肼和強(qiáng)堿共熱下，將1-(3，6-二甲基吡嗪-2-基)乙酮中的羰基還原成亞甲基，從而實(shí)現(xiàn)化合物2-乙基-3，6-二甲基吡嗪的合成。該反應(yīng)簡(jiǎn)單易操作，原料易得，反應(yīng)收率高，能夠有效減少副反應(yīng)的發(fā)生，且產(chǎn)物中不會(huì)有同分異構(gòu)體2-乙基-3，5-二甲基吡嗪生成，大大降低了分離難度。

目前，已有多種方法合成2-乙基-3，6-二甲基吡嗪，如Bohman等[22]利用Minisci反應(yīng)將2，5-二甲基吡嗪在強(qiáng)酸作用下發(fā)生取代反應(yīng)生成2-乙基-3，6-二甲基吡嗪，然而該反應(yīng)需要大量的濃硫酸和雙氧水，且后處理調(diào)pH過程中會(huì)釋放大量的熱量，容易造成產(chǎn)物揮發(fā)或分解。該合成方法僅適用于微量反應(yīng)，不適合工藝放大，難以獲得大量產(chǎn)物。Adams等[23]利用美拉德反應(yīng)(Maillard反應(yīng))合成2-乙基-3，6-二甲基吡嗪，然而，該方法制備得到的產(chǎn)物中會(huì)有較多的副產(chǎn)物生成，難以分離提純，不易于得到較高純度的目標(biāo)產(chǎn)物。

告警信息素是由一種昆蟲釋放并能引起同種個(gè)體釆取防御行為的化學(xué)物質(zhì)。這類信息素主要存在于群集性或社會(huì)性昆蟲中。告警是螞蟻一種非常明顯的行為之一，當(dāng)遇到外界的壓力和威脅時(shí)，螞蟻會(huì)釋放告警信息素，給同伴發(fā)出警告信號(hào)。蟻巢會(huì)針對(duì)即將發(fā)生的危險(xiǎn)部署工蟻及兵蟻?zhàn)龊孟鄳?yīng)的措施。目前已有大量關(guān)于紅火蟻告警信息素及其類似物的相關(guān)報(bào)道，相關(guān)研究指出告警信息素及類似物能夠引起紅火蟻強(qiáng)烈的行為反應(yīng)，如引誘、趨避和聚集等行為[18]。

此外，吡嗪類化合物廣泛存在于螞蟻中，是螞蟻中重要的信息素類物質(zhì)。如猛蟻下頜腺中含有大量吡嗪類化合物，其中2位為烷基取代的3，5-二甲基吡嗪類化合物最為豐富[24-25]；多種收獲蟻(Pogonomyrmex)毒腺的主要成分均為烷基吡嗪類化合物，如2，5-二甲基吡嗪、2，3，5-三甲基吡嗪和3-乙基-2，5-二甲基吡嗪等[26]。2-乙基-3，6-二甲基吡嗪不僅是紅火蟻的告警信息素，而且也廣泛分布在其他螞蟻中，起到相關(guān)信息傳遞和交流的作用，如2-乙基-3，6-二甲基吡嗪是P.barbatus、P.maricopa、P.occidentalis和P.rugosus4種收獲蟻的招募信息素(recruitment pheromone)。

盡管本研究成功合成出紅火蟻告警信息素，然而還需對(duì)告警信息素的作用機(jī)制及其田間活性進(jìn)行分析和驗(yàn)證。通過利用告警信息素對(duì)紅火蟻的特殊作用方式，結(jié)合紅火蟻田間防治方法，探索出一種基于信息素的紅火蟻田間監(jiān)測(cè)和防治技術(shù)。