表油菜素內(nèi)酯對夏黑葡萄幼苗生長的影響

練華山，李欣欣，林立金，廖明安

(1.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院 農(nóng)業(yè)園藝學(xué)院，四川 成都 611130； 2.四川師范大學(xué)附屬第一實驗中學(xué)，四川 成都 611130； 3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 果蔬研究所，四川 成都 611130; 4.園藝學(xué)院，四川 成都 611130)

1970年，Mitchell等[1]在油菜(BrassicanapusL.)花粉的提取物中發(fā)現(xiàn)了一種能促進大豆幼苗生長的物質(zhì)，被命名為“brassins”。1979年，科學(xué)家們從227 kg油菜花粉中分離并提純了brassins，發(fā)現(xiàn)這是一種甾類內(nèi)酯[2]，這類多羥基化且具有相似結(jié)構(gòu)和活性的甾醇類物質(zhì)都被歸為油菜素內(nèi)酯類似物(brassinosteroids，BRs)[3]。它們在極低濃度下即可調(diào)節(jié)和改善植物的生長和發(fā)育，被認為是繼生長素、赤霉素、細胞分裂素、脫落酸、乙烯之后的第六大植物生長調(diào)節(jié)劑[4]。在作物上應(yīng)用的BRs，主要有油菜素內(nèi)酯(BR)、表油菜素內(nèi)酯(EBR)、高油菜素內(nèi)酯(HBR)、丙酰蕓苔素內(nèi)酯和14-羥基蕓苔素甾醇。其中，EBR是一種人工合成的高活性油菜素內(nèi)酯類似物，具有促進植物生長發(fā)育和提高光合作用的能力[5]。研究表明，外源EBR能夠提高植物的生物量[6]，并且能夠提高植物葉片中的光合色素含量(葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量)和葉片的光化學(xué)效率[7]。在植物正常生長發(fā)育過程中，植物固有的抗氧化防御系統(tǒng)可以調(diào)節(jié)和清除少量的活性氧，減少滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的產(chǎn)生。近年來，利用外源BRs防御植物的氧化猝滅已引起廣泛關(guān)注[8-9]。葉面噴施EBR可以提高植物的抗逆性，包括降低電解質(zhì)滲透率和丙二醛(MDA)含量[10-11]，增加葉片的相對含水量和游離脯氨酸(Pro)含量，提高抗氧化酶活性等[12-13]?？傮w上，外源施用EBR對植株的生長特性具有顯著影響。

葡萄(VitisviniferaL.)是世界性果樹，我國葡萄栽培面積位居世界第二[14]，在我國果樹產(chǎn)業(yè)中占重要地位。夏黑葡萄是由巨峰×無核白雜交育成的，該品種早熟優(yōu)質(zhì)、抗病、豐產(chǎn)、耐貯運性良好[15]。近年來，EBR在提高葡萄產(chǎn)量[16]、促進果實品質(zhì)形成[17]、緩解非生物脅迫[18]等方面都有較多的研究，但是有關(guān)EBR促進葡萄幼苗生長和提高抗氧化系統(tǒng)的研究較少。本研究以夏黑葡萄為材料，研究了葉面噴施不同濃度EBR對葡萄幼苗生長的影響，旨在為提高幼苗抗逆性和培育健壯的夏黑葡萄幼苗提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為夏黑葡萄一年生扦插苗，來源于四川省崇州市四川農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研發(fā)基地夏黑葡萄園。2018年冬季修剪時收集生長健壯且長勢一致、無病蟲害的一年生葡萄枝條，進行沙藏保存。

供試土壤為潮土，其基本理化性質(zhì)如下：pH值7.71，有機質(zhì)15.29 mg·g-1，全氮0.85 mg·g-1，堿解氮87.99 mg·kg-1，全磷11.88 mg·g-1，速效磷55.78 mg·kg-1，速效鉀41.96 mg·kg-1，全鉀15.38 mg·g-1。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2019年2—8月在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)進行。2019年2月上旬將無污染的潮土風干、壓碎，過5 mm篩，取3.0 kg裝入盆(高15 cm，直徑18 cm)中，保持濕潤，靜置3周備用。

2019年2月中旬，將沙藏保存的夏黑葡萄插條取出，對其進行修剪(帶一個健壯的飽滿芽，長約7 cm)后扦插于裝有珍珠巖的穴盤(50孔)中，育苗所用珍珠巖為含水量為2%～6%的浮石狀灰白色珍珠巖，置于晝夜為21～23 ℃的人工氣候室中。

2019年3月中旬選取健壯、長勢一致的扦插幼苗(株高約15 cm)移栽到裝有供試土壤的盆中，置于人工氣候室進行培養(yǎng)，白天(24±0.5)℃，夜晚(15±0.5)℃，光周期為12 h/12 h(L/D)，光合有效輻射為200 μmol·m-2·s-1。

幼苗移栽15 d后，分別噴施不同濃度(0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1)的EBR水溶液，對照組噴施等量清水。噴施時間為每天09:00，噴施時以葉面濕潤滴液為度。每個處理每次噴施60 mL，單獨噴施，避免不同濃度交互影響，每隔7 d噴1次，連續(xù)噴施3次。每個處理3盆，每盆3株，重復(fù)3次。隨機擺放于光照培養(yǎng)室內(nèi)，盆間距10 cm，每3 d交換位置以減弱邊際效應(yīng)的影響。

1.3 指標測定

最后一次噴施后第8天，采收樣品，測定相關(guān)指標。

1.3.1 生物量

收獲整株夏黑葡萄幼苗，用自來水洗凈，再用去離子水沖洗3次，分為根、莖、葉，于110 ℃殺青15 min，75 ℃烘干至質(zhì)量不變，用電子天平稱取各部位生物量，并計算根冠比。

1.3.2 氣體交換參數(shù)

選取生長點以下第二片完全展開的葉片，用LI-6400便攜式光合儀(Li-CorInc.，USA)進行測定。測定葉片的凈光合速率(photosynthetic rate，Pn)、氣孔導(dǎo)度(conductance stomatal，Gs)、蒸騰速率(transpiration rate，Tr)、胞間CO2濃度(intercellular CO2concentration，Ci)和葉溫下蒸氣壓虧缺值(vapor pressure deficit value at leaf temperature， VpdL)。

1.3.3 光合色素含量

稱取0.2 g幼苗葉片，采用浸泡法測定(乙醇∶丙酮體積比1∶1)，并分別計算葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和總?cè)~綠素的含量(葉綠素a含量+葉綠素b含量)[19]。

1.3.4 抗氧化酶活性

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性用氮藍四唑(mitrobluetetrazolium，NBT)光化還原法測定；過氧化物酶(peroxidase，POD)活性用愈創(chuàng)木酚法測定，以每min內(nèi)D470變化0.1為1個酶活性單位(U·g-1·min-1)；過氧化氫酶(catalase，CAT)活性用高錳酸鉀滴定法測定，以每g鮮重樣品1 min內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示(mg·g-1·min-1)[19]。

1.3.5 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)

可溶性蛋白質(zhì)含量用考馬斯亮藍-G250比色法測定；丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量用硫代巴比妥酸法測定；游離脯氨酸含量(proline，Pro)用酸性茚三酮比色法測定；可溶性糖含量用蒽酮比色法測定[19]；相對電導(dǎo)率用電導(dǎo)率儀測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)進行記錄和整理；SPSS 20.0進行方差分析和相關(guān)性分析；采用Duncan新復(fù)極差法進行多重比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 EBR對夏黑葡萄幼苗生物量的影響

由表1可知，噴施EBR后，葡萄幼苗各部分生物量和總生物量均高于對照組。當EBR為1.0 mg·L-1時，幼苗根的生物量達到最高，比對照組高55.68%(P<0.05)。莖、葉、地上部分和整株生物量的變化具有相同的趨勢，各處理生物量大小排序為：1.5 mg·L-1EBR>1.0 mg·L-1EBR>2.0 mg·L-1EBR>0.5 mg·L-1EBR>對照組，莖、葉、地上部分和整株生物量均在1.5 mg·L-1EBR處理時達到最高，較對照組分別提高114.39%、29.27%、38.47%和42.49%。幼苗的根冠比在0.5 mg·L-1EBR處理時最大，隨后下降，但均高于對照組。綜上，葉面噴施EBR能提高幼苗的生物量。

表1 EBR對夏黑葡萄幼苗生物量的影響

2.2 EBR對夏黑葡萄幼苗光合色素含量的影響

由表2可知，噴施EBR提高了葡萄幼苗的光合色素含量。當葉面噴施EBR為1.0 mg·L-1時，葡萄幼苗的葉綠素a和葉綠素b含量達到最高，分別較對照組提高了33.06%和40.68%。類胡蘿卜素含量在EBR為1.5 mg·L-1時達到最高，較對照組增加了16.56%?？?cè)~綠素含量在EBR為2.0 mg·L-1時達到最高。葉綠素a/b均表現(xiàn)出低于對照組，并且隨EBR濃度的增加呈現(xiàn)下降趨勢。葉綠素含量的變化規(guī)律和生物量的變化基本一致，推測噴施EBR促進了葡萄幼苗的光合作用，從而增加了葡萄幼苗的生物量。

表2 EBR對夏黑葡萄幼苗光合色素含量的影響

2.3 EBR對夏黑葡萄幼苗光合參數(shù)的影響

噴施EBR顯著提高了葡萄幼苗葉片Tr、Pn、Ci和Gs，而VpdL較對照組顯著降低(表3)。當EBR為0.5 mg·L-1時，葡萄幼苗葉片的Tr達到最大，較對照組提高了27.89%(P<0.05)；EBR為1.5 mg·L-1時次之，較對照組提高了26.01%(P<0.05)。當EBR為1.5 mg·L-1時，Pn、Ci和Gs的值均達到最大，分別較對照組提高158.05%(P<0.05)、39.77%(P<0.05)和50.00%(P<0.05)；EBR為0.5 mg·L-1時次之，且較對照組提高了105.49%(P<0.05)、27.02%(P<0.05)和43.75%(P<0.05)。葉面噴施不同濃度EBR顯著降低了葡萄幼苗葉片的VpdL，1.5 mg·L-1EBR處理的VpdL降低幅度最小，較對照組減少了8.61%(P<0.05)。

表3 EBR對夏黑葡萄幼苗光合參數(shù)的影響

2.4 EBR對夏黑葡萄幼苗抗氧化酶活性的影響

葉面噴施EBR提高了葡萄幼苗的抗氧化酶(POD、SOD和CAT)活性，且隨EBR濃度的升高呈先上升后下降的趨勢(表4)。當EBR為1.0 mg·L-1，葡萄幼苗的SOD、POD與CAT的活性達到最高，分別較對照組提高了70.74%(P<0.05)、52.73%(P<0.05)和123.26%(P<0.05)，在1.5 mg·L-1EBR處理時次之。

表4 EBR對夏黑葡萄幼苗抗氧化酶活性的影響

2.5 EBR對夏黑葡萄幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

由表5可知，葉面噴施不同濃度EBR，葡萄幼苗葉片中MDA含量均低于對照組，且在1.0 mg·L-1EBR處理時達到最低，較對照組降低了43.75%(P<0.05)。葉面噴施EBR后，葡萄幼苗葉片中脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)含量均高于對照組，EBR濃度為1.0 mg·L-1時達到最高，較對照組分別增加了50.90%(P<0.05)和50.28%(P<0.05)。當EBR濃度為0.5 mg·L-1和2.0 mg·L-1時，葉片中的相對電導(dǎo)率均顯著高于對照組，較對照組分別增加了6.25%(P<0.05)和3.22%(P<0.05)，其余濃度處理則顯著低于對照組。

表5 EBR對夏黑葡萄幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

2.6 EBR對夏黑葡萄幼苗可溶性糖含量的影響

由表6可知，葉面噴施EBR后葡萄幼苗葉片各部位的可溶性糖含量變化趨勢不同。除了0.5 mg·L-1EBR處理，葉面噴施EBR后葡萄幼苗根的可溶性糖含量均高于對照組，其中，EBR為2.0 mg·L-1時達到最高，較對照組增加了59.57%(P<0.05)。0.5 mg·L-1和1.0 mg·L-1EBR處理的葡萄幼苗莖的可溶性糖含量低于對照組，其余處理均顯著高于對照組；EBR為2.0 mg·L-1時達到最高，較對照組增加了14.03%(P<0.05)。1.5 mg·L-1和2.0 mg·L-1EBR處理的葡萄幼苗葉片可溶性糖含量低于對照組，其余處理均顯著高于對照組， EBR為1.0 mg·L-1時達到最高，較對照組增加了38.19%(P<0.05)。

3 討論

BRs能促進植物細胞的伸長和分裂，提高生物量[20]。葉面噴施不同濃度的EBR提高了夏黑葡萄幼苗的生物量和根冠比。適宜濃度EBR促進植物的幼莖伸長、提高幼苗生物量的主要原因如下：一是與植物激素的相互作用，EBR與生長素能夠相互作用，加快細胞分裂；二是EBR會刺激質(zhì)膜上的ATP酶活性，使質(zhì)膜分泌產(chǎn)生的H+轉(zhuǎn)移到細胞壁，從而使細胞伸長[21]，提高植物幼苗的生物量。

葉綠素分子以色素—蛋白質(zhì)復(fù)合物的形式存在于葉綠體中，不僅吸收和傳遞光能，還可將光能轉(zhuǎn)化為電能，其含量的多少及其組成決定了植物對不同光的吸收和利用率。葉綠素a/b的值反映了類囊體膜的垛疊程度，且成正相關(guān)，其數(shù)值降低代表膜垛疊減少，導(dǎo)致植物對光量子的有效吸收、傳遞和利用降低，從而降低光能轉(zhuǎn)化為生物化學(xué)能的效率[22]。有關(guān)EBR影響光合作用的研究中發(fā)現(xiàn)，EBR參與光形態(tài)建成和光信號傳導(dǎo)[23]。對馬鈴薯幼苗葉面噴施不同濃度的EBR時，幼苗葉片中的光合色素含量顯著下降，但是葉綠素a/b并未出現(xiàn)顯著變化[24]。葉面噴施不同濃度EBR提高了葡萄幼苗的光合色素(葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素)含量，降低了葉綠素a/b的值，其原因可能是幼苗葉面噴施EBR后葉綠素b含量增加，可以增加對光能的捕獲，但是幼苗的光合作用能力有限，過多的光能會使活性氧產(chǎn)生，從而增加蛋白質(zhì)的降解[25]，進而影響核心光系統(tǒng)蛋白質(zhì)含量與光合復(fù)合物蛋白質(zhì)含量的比值，使得葉綠素a/b的值發(fā)生變化[23]。隨著光合色素含量的增加，氣體交換參數(shù)也發(fā)生了變化：噴施不同濃度EBR的葡萄幼苗葉片氣體參數(shù)(Tr、Pn、Ci、Gs)都顯著增加，VpdL顯著降低。VpdL的降低增加了葉片的水分利用效率，能夠促進光合作用[26]。研究表明，BRs可提高小麥葉片1， 5-二磷酸核酮糖羧化酶的活性，使葉片吸收CO2的速度加快，提高光合速率[27]。當外源施用有益物質(zhì)時，可能會提高植物PSⅡ(photosynthetic systemⅡ)的光化學(xué)活性，使光合酶如PEP羧化酶、RuBP羧化酶活性上升，增強光合電子向電子受體(QA、QB)與質(zhì)體醌(PQ)的傳遞，從而改變光系統(tǒng)的運轉(zhuǎn)效率[28]，影響光合參數(shù)。

植物在正常生長過程中會產(chǎn)生過量活性氧，但是植物體內(nèi)的SOD、POD、CAT等抗氧化酶能夠及時清除過多的活性氧，從而保護植物免受活性氧的傷害。Tadaiesky等[29]研究發(fā)現(xiàn)，外源EBR提高了植物SOD、CAT、POD、APX(ascorbate peroxidase)等抗氧化酶的活性，減輕了氧化損傷。Kohli等[30]的研究也表明，SOD、POD、CAT等抗氧化酶基因表達水平的升高可能是EBR處理后抗氧化防御系統(tǒng)活性增強的原因。葉面噴施EBR提高了夏黑葡萄幼苗葉片抗氧化酶活性。這與Tadaiesky等[29]在水稻上和Kohli等[30]在芥菜上的試驗結(jié)果相似。推測外源EBR使這些酶活性升高的原因如下：一是EBR可能調(diào)節(jié)各種抗氧化酶基因的表達，因為這些基因介導(dǎo)酶的活性和從頭合成[31]；二是BRs能調(diào)控細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)，如BR信號激酶1(BSK 1)，能夠接受不利影響的信號，從而調(diào)節(jié)植物細胞內(nèi)源性水楊酸的水平[32]，影響抗氧化系統(tǒng)。

植物細胞膜對維持細胞的微環(huán)境和正常代謝起著重要的作用。在正常情況下，細胞膜對物質(zhì)具有選擇透性能力；如果細胞膜遭到破壞，膜透性增大，從而使細胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，以致植物細胞的電導(dǎo)率增大。葉片噴施不同濃度EBR提高了葡萄幼苗葉片的脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)的含量，降低了MDA含量；不同濃度EBR對葡萄幼苗根、莖和葉中的可溶性糖含量影響不同，0.5 mg·L-1和1.0 mg·L-1EBR處理提高了葉片的可溶性糖含量；當EBR濃度為1.0 mg·L-1和1.5 mg·L-1時，葉片的相對電導(dǎo)率降低。這些結(jié)果與Peng等[33]和Zhong等[11]的結(jié)果相似，即EBR可以使幼苗通過增加可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量來提高幼苗的抗性，保護細胞結(jié)構(gòu)和功能，但是不同濃度EBR對植株葉片的滲透調(diào)節(jié)作用不同。

本研究結(jié)果表明，葉面噴施不同濃度EBR促進了夏黑葡萄幼苗葉片的生長，其生物量、光合色素含量、光合參數(shù)、抗氧化酶活性、可溶性蛋白質(zhì)和脯氨酸的含量都有所提高，且EBR濃度為1.0 mg·L-1和1.5 mg·L-1時效果最好；EBR濃度為1.0 mg·L-1時，葡萄幼苗葉片可溶性糖和相對電導(dǎo)率表現(xiàn)較好。綜上所述，葉面噴施1.0 mg·L-1EBR最有利于夏黑葡萄幼苗生長。