車前草治療隱匿性腎炎的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制

劉 浪，莫 易，朱蠡慶，付 雪，姚 波

重慶科技學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，重慶401331

隱匿性腎炎（latent nephritis）僅表現(xiàn)為輕度蛋白尿和腎小球源性血尿，無水腫、高血壓及腎功能損害，故又被稱為無癥狀性蛋白尿和血尿［1］。其以隱匿性強(qiáng)、病情輕微、病程綿長、易復(fù)發(fā)為特點(diǎn)［2］。據(jù)報(bào)道，隱匿性腎炎是由于腎血管出現(xiàn)持續(xù)痙攣和充血，腎小球?yàn)V過膜的通透性出現(xiàn)損害而導(dǎo)致的［3］。此外，有研究表明如果不能及時(shí)對(duì)隱匿性腎炎進(jìn)行治療，有出現(xiàn)腎功能衰竭的可能性，從而嚴(yán)重影響患者的生命健康［4］。目前針對(duì)隱匿性腎炎，西醫(yī)尚無特異性的治療方案，而中醫(yī)治療秉承辨證論治的原則，結(jié)合辨病施治，相對(duì)西醫(yī)來講目前有較高的可行性［5］。臨床在治療隱匿性腎炎方面常以車前草作為重要中藥進(jìn)行治療。車前草又名車前，為車前科植物車前的干燥全草［6］。其含有桃葉珊瑚苷、車前苷等成分，有利尿、抗菌、消炎、降血壓等作用［7］。金順英等［8］將30 例單純血尿患者隨機(jī)分組，治療組每日服鮮車前草汁，對(duì)照組注意休息，預(yù)防感染。8 周后治療組總有效率達(dá)85% 以上，而對(duì)照組尿常規(guī)改變不明顯，僅38.7% 有效，兩者有顯著性差異。此外，徐明等［9］擬益氣滋腎清利活血法對(duì)比腎炎康復(fù)片，各治療30 例隱匿性腎炎，結(jié)果表明益氣滋腎清利活血法療效明顯優(yōu)于腎炎康復(fù)片。由此可見，車前草對(duì)治療隱匿性腎炎具有十分重要的作用。然而，目前尚未有以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度闡明車前草治療隱匿性腎炎作用機(jī)制的研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種建立在計(jì)算機(jī)基礎(chǔ)上的研究中藥藥理的新模式，其可闡明中藥活性成分及作用機(jī)制，預(yù)測中藥作用靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)新的適應(yīng)癥，從而增加中藥及其制劑的認(rèn)可度和接受度［10］。本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與生物信息學(xué)結(jié)合的方法，通過對(duì)車前草活性成分，作用靶點(diǎn)及對(duì)應(yīng)的生物信號(hào)通路進(jìn)行分析，探討車前草治療隱匿性腎炎的作用機(jī)制與物質(zhì)基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究車前草治療隱匿性腎炎的分子機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 車前草活性成分的篩選與收集

以車前草為主題在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）中收集相關(guān)活性成分，設(shè)置篩選條件為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30% ，藥 物類藥性（durg-like properties ，DL）≥0.18［11］，Caco-2≥-0.4［12］。

1.2 車前草活性成分靶點(diǎn)蛋白的篩選

利用TCMSP 和Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫（http：//swisstargetprediction.ch/），篩選出活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白，將靶點(diǎn)蛋白輸入U(xiǎn)niprot 數(shù)據(jù)庫（https：//www. uniprot. org/）和Drugbank 數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.drugbank.com/）規(guī)范對(duì)應(yīng)基因名。

1.3 獲取隱匿性腎炎疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)

本研究以latent nephritis 為關(guān)鍵詞在OMIM 數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/）和Genecards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）中檢索并獲取與隱匿性腎炎相關(guān)的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)，將在兩個(gè)數(shù)據(jù)庫中獲得的靶點(diǎn)基因進(jìn)行合并，刪去重復(fù)值，得到隱匿性腎炎對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因。

1.4 車前草成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中獲得的車前草相關(guān)靶點(diǎn)基因信息進(jìn)行整理，將整理的Network 和Type文件導(dǎo)入Cytoscape 中以Degree 值為指標(biāo)進(jìn)行分析，Degree值越高，節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的作用就越大［13］。因此本研究選擇Degree 值較高的前15 位靶點(diǎn)基因作為治療隱匿性腎炎的主要靶點(diǎn)基因。并利用Cytoscape 軟件得到車前草成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 獲取車前草與隱匿性腎炎的共同基因

利 用Venny2.1.0 平 臺(tái)（https：//bioinfogp. cnb.csic.es/tools/venny/）對(duì)車前草活性成分靶點(diǎn)蛋白和隱匿性腎炎疾病靶點(diǎn)蛋白的結(jié)果進(jìn)行取交集操作，獲取車前草治療隱匿性腎炎的關(guān)鍵基因。

1.6 車前草-隱匿性腎炎蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)可從生物化學(xué)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)角度出發(fā)研究化合物和疾病相關(guān)蛋白間的相互作用關(guān)系［14］。本研究將車前草與隱匿性腎炎的交集基因?qū)隨tring 數(shù)據(jù)庫（https：//stringdb.org/）定義來源為Homo sapiens 進(jìn)行分析，設(shè)置最低相互作用閾值為medium confidence=0.4［15］，獲取蛋白質(zhì)相互作用信息，將獲得的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 軟件中分析得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析

R 語言可以對(duì)基因集合進(jìn)行功能聚類的統(tǒng)計(jì)分析和可視化［16］，本研究利用R 語言中的Cluster Profiler、Path View 等數(shù)據(jù)包對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行GO和KEGG 富集分析，以P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)，繪制得到GO-BP、GO-CC、GO-MF 和KEGG 通路柱形圖與氣泡圖。

1.8 分子對(duì)接

在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（protein data bank，PDB， https：//www. rcsb. org/）中下載AKT1、VEGFA、TP53 的3D 結(jié)構(gòu)，利用Pymol 軟件去掉水和其余化合物，再通過AutoDockTools 軟件加氫。在PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載活性成分的2D 結(jié)構(gòu)，借助Chem3D 將2D 結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為最小自由能的3D 結(jié)構(gòu)，最后通過Pymol畫出最小結(jié)合能的構(gòu)象。

2 結(jié)果與討論

2.1 車前草有效活性成分信息收集

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫，以車前草為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，并以O(shè)B≥30%，DL≥0.18，Caco-2≥-0.4 為篩選條件，共篩選得到8 種有效活性成分，對(duì)應(yīng)的信息如表1 所示。

表1 車前草活性成分信息表Tab.1 Active ingredients of plantain

2.2 車前草成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

以1.4 的步驟進(jìn)行操作，得到車前草成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖如圖1 所示。圖1 中CQC1 為丁那丁、CQC2 為黃芩素、CQC3 為谷甾醇、CQC4 為6-羥基木犀草素、CQC5 為豆甾醇、CQC6 為木犀草素、CQC7 為棕櫚酸豆甾醇醋、CQC8 為β-谷甾醇棕櫚酸酯。

根據(jù)Cytoscape 分析結(jié)果顯示，圖1 共有266個(gè)節(jié)點(diǎn)，358 條邊。以Degree 值為分析指標(biāo)結(jié)果顯示，β-谷甾醇棕櫚酸酯、棕櫚酸豆甾醇醋的度值為101，木犀草素的度值為58，黃芩素的度值為38。度值越高，節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的作用就越大［13］。而上述4 種活性成分的度值遠(yuǎn)大于其他活性成分。因此，本研究選取度值排名前四的活性成分作為治療隱匿性腎炎的主要活性成分。

2.3 車前草-隱匿性腎炎共同靶點(diǎn)的篩選

將通過數(shù)據(jù)庫獲取得到的車前草對(duì)應(yīng)基因256 個(gè)與隱匿性腎炎對(duì)應(yīng)基因832 個(gè)利用Venny2.1.0 平臺(tái)取交集處理后共獲得85 個(gè)交集基因。結(jié)果如圖2 所示。

2.4 車前草-隱匿性腎炎蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將85 個(gè)交集基因?qū)隨tring 數(shù)據(jù)庫和Cytoscape 軟件中，得到交集基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果如圖3 所示。

將85 個(gè)交集基因?qū)隨tring 數(shù)據(jù)庫中，分析得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)共有105 個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 536 條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值為29.3。 再將String 數(shù)據(jù)結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 中得到如圖3 所示的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。以Network Analyzer 等插件對(duì)基因靶點(diǎn)進(jìn)行分析。度值（Degree）、最短路徑（Closeness）是判斷一個(gè)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)重要性的主要拓?fù)鋮?shù)，度值和最短路徑越大，節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮的作用就越大［17］。因此，本研究篩選度值和最短路徑排名前15 位的基因?yàn)楹诵幕颍鐖D3 綠色圓圈所示。核心基因的具體度值和最短路徑指數(shù)如表2 所示。根據(jù)圖3和表2 分析結(jié)果可知，TP53、VEGFA、AKT1 等核心基因最有可能是治療隱匿性腎炎的核心基因。研究表明，IL6 在炎癥調(diào)控中作為重要物質(zhì)參與抗腫瘤過程［18］。VEGFA 異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致腎臟的高濾過、基底膜增厚、腎小球肥大，從而加劇了腎功能惡化［19］。AKT1 是一種蛋白激酶，該蛋白參與多種生物學(xué)過程，包括細(xì)胞代謝、增殖，結(jié)合多條信號(hào)通路，達(dá)到治療隱匿性腎炎的目的［20］。TP53是重要的凋亡基因，通過調(diào)控BCL2 線粒體凋亡機(jī)制可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［21］。這些核心基因可能是車前草治療隱匿性腎炎的重要靶點(diǎn)。

表2 核心基因度值與最短路徑分值表Tab. 2 Core gene degree values and closeness scores

圖3 車前草與隱匿性腎炎蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig. 3 Protein interaction network of plantain and latent nephritis

2.5 GO 和KEGG 通路富集分析

利用R 語言對(duì)交集基因進(jìn)行GO 富集分析，得到GO 富集分析柱形圖如圖4 所示。

圖4 是以P＜0.05 為條件，通過篩選其中P 值較小的前10 個(gè)生物功能條目得到的富集分析結(jié)果圖，柱體顏色越紅，富集程度就越高；矩形柱體越長，參與基因就越多。在GO BP 富集分析過程中，車前草主要參與氧化應(yīng)激反應(yīng)（response to oxidative stress）、細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)（cellular response to chemical stress）、活性氧代謝過程（reactive oxygen species metabolic process）等生物過程；在GO CC 富集分析中，包含膜筏（membrane raft）、膜微區(qū)（membrane microdomain）等10 個(gè)條目；在GO MF 富集分析中，車前草主要參與RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding）、細(xì)胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）、蛋白酪氨酸激酶活性（protein tyrosine kinase activity）等生物功能過程。

圖4 GO 富集分析柱形圖Fig. 4 Column chart of GO enrichment analysis

圖5 是以P＜0.05 為條件，通過篩選P值較小的前30 條信號(hào)通路所得的KEGG 通路富集分析氣泡圖。圈體顏色越紅，富集程度越高；圈體面積越大，參與基因越多。

由圖5 可知，交集基因主要集中在PI3K-Akt信號(hào)通路（P13K-Akt signaling pathway）、流體剪切應(yīng)力（Fluid shear stress and atherosclerosis）與癌癥中的蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）等信號(hào)通路中。這幾條通路最有可能是車前草治療隱匿性腎炎的信號(hào)通路。TP53、AKT1、VEGFA 等核心基因主要分布在以上信號(hào)通路中，通過調(diào)控不同的信號(hào)通路達(dá)到治療隱匿性腎炎的目的。

圖5 KEGG 通路富集分析氣泡圖Fig. 5 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis

GO 富集分析結(jié)果顯示，上述核心基因可能通過氧化應(yīng)激反應(yīng)、活性氧代謝過程、細(xì)胞因子受體結(jié)合、蛋白酪氨酸激酶活性等生物功能過程達(dá)到抗隱匿性腎炎的目的。研究發(fā)現(xiàn)可調(diào)節(jié)表皮生長因子受體酪氨酸激酶，抑制血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的損失，從而維系腎小球?yàn)V過屏障［22］。KEGG 通路富集分析結(jié)果表明，車前草治療隱匿性腎炎的核心基因主要集中在PI3K-Akt 信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路、癌癥中的蛋白多糖等信號(hào)通路。PI3K-Akt 信號(hào)通路的失活和糖尿病腎病中CTGF 表達(dá)的抑制相關(guān)，進(jìn)而減輕腎細(xì)胞外基質(zhì)積聚，從而抑制患者腎臟惡變進(jìn)程［23］。綜上所述，PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心基因主要是參與多種生物功能過程，協(xié)調(diào)多條信號(hào)通路達(dá)到治療隱匿性腎炎的目的。

2.6 分子對(duì)接

使用Vina 對(duì)接模擬將活性成分和蛋白進(jìn)行分子對(duì)接并計(jì)算結(jié)合能，設(shè)置參數(shù)為center（x，y，z）=（0.666 7，0.306，0.917）、size（x，y，z）=（36，52，26）、energy-range=5，num-modes=20 篩選度值大小前4位的活性化合物與AKT1、VEGFA、TP53 進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果如表3 和圖6 所示。

表3 車前草活性化合物與AKT1、TP53、VEGFA 的結(jié)合能Tab. 3 Binding energies of active compounds of plantain with AKT1，TP53 and VEGFA

圖6 三種成分的分子對(duì)接結(jié)果圖Fig. 6 Docking results of three compounds

普遍認(rèn)為配體與受體結(jié)合時(shí)能量越低越穩(wěn)固，發(fā)揮的作用越大。表3 結(jié)果顯示，4 種活性化合物與AKT1、TP53、VEGFA 的結(jié)合能均較低，其中VEGFA 的結(jié)合能稍大于TP53 和AKT1，說明其在治療隱匿性腎炎的過程中發(fā)揮的作用稍弱于TP53 和AKT1，這與度值分析結(jié)果不謀而合。圖6根據(jù)結(jié)合能分析結(jié)果，篩選具有最低結(jié)合能的化合物蛋白組合進(jìn)行分子對(duì)接模擬，從分子結(jié)構(gòu)層面驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果。為了進(jìn)一步了解車前草治療隱匿性腎炎的作用機(jī)制，通過分子對(duì)接模擬結(jié)果可知，黃岑素、木犀草素、豆甾醇、棕櫚酸豆甾醇醋、β-谷甾醇棕櫚酰酯能與TP53、AKT1、VEGFA 自由結(jié)合，且其結(jié)合能均較低，其中黃岑素、豆甾醇、木犀草素等黃酮、甾體類化合物與VEGFA、AKT1、TP53 的結(jié)合能最低，說明在車前草治療隱匿性腎炎的過程中，主要是通過黃銅和甾體類化合物協(xié)同VEGFA、AKT1、TP53 等核心基因，參與多條信號(hào)通路從而達(dá)到治療隱匿性腎炎的目的，這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果不謀而合。

3 結(jié) 論

隱匿性腎炎患者發(fā)病隱匿，病情加深會(huì)引發(fā)尿毒癥，嚴(yán)重威脅患者生命安全。上海市名中醫(yī)葉景華從事60 余年的臨床腎病研究認(rèn)為，該病的主要病因源于熱與虛，臨床上常采用琥珀、三七等活血化瘀和具有利尿功效的藥物［5，24］。而車前草不僅具有同樣的利尿功效，相比與琥珀、三七等名貴中藥材，車前草具有產(chǎn)量大，成本低的優(yōu)勢。故本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究模式，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共篩選得到8 種車前草有效成分，以Degree值篩選 β -sitosteryl palmitate、 stigmasteryl palmitate、木犀草素、黃岑素為主要活性成分。木犀草素可通過調(diào)控多種信號(hào)通路誘導(dǎo)腫瘤壞死因子的生成，從而發(fā)揮其抗腫瘤的藥理作用［25］。黃岑素發(fā)揮抗腫瘤作用機(jī)制多樣，可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡達(dá)到治療的目的［26］。再通過PPI 網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)TP53、VEGFA、AKT1 等核心基因最有可能是治療隱匿性腎炎的核心基因。最后通過GO 富集分析和KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)車前草中的核心基因可能通過參與蛋白酪氨酸激酶等生物功能過程，協(xié)同參與PI3K-Akt 信號(hào)通路達(dá)到治療隱匿性腎炎的目的。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，結(jié)合相關(guān)的臨床藥理研究，對(duì)車前草治療隱匿性腎炎的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。研究結(jié)果初步表明車前草相關(guān)活性成分，通過參與相關(guān)生物學(xué)通路和過程治療隱匿性腎炎，但具體結(jié)果仍需要相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證明。