鹽堿脅迫對文冠果葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響1)

宗建偉 溫瑩瑩 楊雨華

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學院，鄭州，450046)

我國鹽堿化土地主要分布在華北平原、東北平原、西北內(nèi)陸地區(qū)及濱海地區(qū)，分布范圍廣、面積大、種類多。土地鹽堿化，導致土壤肥力降低，對農(nóng)作物生長產(chǎn)生不利影響，但大部分鹽堿化地區(qū)氣候資源豐富、土層深厚、地勢平坦、開發(fā)潛力巨大[1]。文冠果(XanthocerassorbifoliaBunge)為落葉灌木或小喬木，樹形優(yōu)美、枝葉茂盛，是優(yōu)良的園林觀賞樹種。其種子含油率為35%～40%、種仁含油率為62.8%～72.0%，素有“北方油茶”之稱[2]。文冠果根系發(fā)達，能充分吸收和貯藏水分，對土地的適應性很強，耐鹽堿[3]，抗寒能力強，是我國三北地區(qū)防風固沙、治理荒漠化和改善土地鹽漬化的優(yōu)良樹種[4]。因此，文冠果可作為我國鹽堿地改良最有前景的樹種之一。

當自然環(huán)境改變時，植物會通過形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化的變化去適應環(huán)境[5]，土壤鹽分不僅能改變植物代謝機制，還影響植物正常生長，尤其是植物的形態(tài)和解剖學特征[6]。葉片是植物對環(huán)境反應最敏感、最明顯的器官，可塑性大[7]。在NaCl脅迫環(huán)境中，植物葉表皮變薄，柵欄組織和海綿組織層數(shù)、細胞直徑和細胞間隙變小，從而使葉肉厚度減小[8]，但鹽分脅迫致使葉片形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)在種間和種內(nèi)產(chǎn)生較大差異，也與植物個體發(fā)育階段有關[9]。近年來，關于鹽堿與葉片解剖結(jié)構(gòu)之間的關系研究日益增多，在不同種間證明鹽堿與葉片解剖結(jié)構(gòu)密切相關[10-11]。但是，關于文冠果在逆境下葉片解剖結(jié)構(gòu)的研究，主要集中在不同種源文冠果耐旱機制的對比[12-14]；而關于鹽堿脅迫對文冠果葉片解剖結(jié)構(gòu)影響的研究較少。

本研究以種源為河南濟源地區(qū)的1年生文冠果(XanthocerassorbifoliaBunge)幼苗為試驗材料，設置中性鹽和堿性鹽脅迫試驗，采用石蠟切片技術，分析鹽堿脅迫對文冠果葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響，旨在為改善河南地區(qū)鹽堿地生態(tài)環(huán)境和文冠果栽培應用提供參考。

1 材料與方法

試驗材料：試驗在河南牧業(yè)經(jīng)濟學院的苗圃地(東經(jīng)113°81′，北緯34°79′)進行。選取河南濟源種源的成熟文冠果種子沙藏處理，沙藏基質(zhì)為粗砂和細沙，按照V(粗砂)∶V(細沙)為6∶4的比例充分混合，加水濕潤，潮濕即可。待沙藏45 d后取出種子，移入盛裝(2.000±0.005)kg的基質(zhì)(V(草炭土)∶V(珍珠巖)=5∶1)、質(zhì)量為0.1 kg的花盆內(nèi)(上口徑250 mm、高180 mm)，每盆1株，共240盆，置于苗圃地內(nèi)自然生長，生長期間定期澆水，除草。

試驗處理：選取長勢良好、沒有病蟲害、株高基本一致的1年生文冠果幼苗，進行試驗處理。采用河南地區(qū)鹽堿地中常見的2種鹽(中性鹽NaCl、堿性鹽Na2CO3)，根據(jù)Na+的濃度，分別設置4個中性鹽NaCl(70、140、210、280 mmol/L)處理、4個堿性鹽Na2CO3(35、70、105、140 mmol/L)處理、1個清水處理(對照，CK)，共9個處理組，每個處理3次重復。處理液分3次澆完，每隔3 d澆1次，每次300 mL，并在塑料盆底放置塑料托盤，防止處理液外漏對試驗造成誤差。將塑料盆移入規(guī)格為3 m×3 m的遮雨棚中，在托盤下放置較厚的木質(zhì)板，增高處理盆地勢，防止雨水對試驗造成其他變量影響。脅迫期間，定期、定量澆水。脅迫45 d后，每株選取健壯、無焦枯、無病蟲害的葉片進行采摘。

測定方法：將采摘的葉片洗凈，用干凈的濾紙吸干水分，用小刀將葉片裁剪成規(guī)格為5 mm×5 mm方形小塊，放入盛有FAA固定液(V(乙醇)∶V(冰醋酸)∶V(甲醛)=0.90∶0.05∶0.05)的10 mL的青霉素瓶中，固定24 h后用試劑丙三醇(V(酒精)∶V(丙三醇)=0.5∶0.5)進行軟化處理，并用注射針管抽氣；采用番紅-固綠染色法，將樣品進行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，最終用中性樹膠進行封片，制成石蠟切片。將處理好的切片使用Motic 210光學顯微鏡進行觀察，并使用Motic Images Advanced3.2高級圖像處理軟件放大100倍進行測量與拍照，對切片進行指標觀測，包括葉片的厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、上表皮層厚度、下表皮層厚度等，并計算柵海比、柵欄組織和葉片厚度比。每項指標觀測5次，取平均值。

數(shù)據(jù)處理：文冠果葉片解剖數(shù)據(jù)，采用Microsoft Excel 2017軟件進行整理與計算，用SPSS22.0軟件進行方差分析、相關性分析、主成分分析和通徑分析。

2 結(jié)果與分析

由圖1可見：文冠果葉片是典型的異面葉，由角質(zhì)層、上下表皮、柵欄組織、海綿組織和維管組織構(gòu)成。文冠果葉片角質(zhì)層為蠟質(zhì)，上下表皮均為單層細胞，著色較深；上表皮細胞切面整體呈規(guī)則長方形狀；下表皮細胞與上表皮細胞相比較小，排列緊密。上表皮層下方為柵欄組織，柵欄組織細胞呈長條形和柱狀，與葉表皮呈垂直分布，排列緊密。海綿組織位于柵欄組織與下表皮之間，海綿組織由多層細胞構(gòu)成，細胞較大，排列疏松，中間含有氣室和較大間隙；維管束呈半環(huán)形圓弧狀分布，其中木質(zhì)部排列緊密整齊，具有運輸?shù)闹蔚淖饔谩?/p>

2.1 鹽堿脅迫對文冠果葉片表皮特征的影響

由圖1、表1可見：隨著NaCl處理濃度的增大，文冠果葉片厚度先增加后下降，且高濃度處理(210、280 mmmol/L)與對照(CK)差異達顯著水平(P<0.05)；在濃度為280 mmol/L的NaCl脅迫時，葉片厚度比對照降低23.40%。隨NaCl處理濃度的升高，文冠果葉片上、下表皮厚度和角質(zhì)層厚度均呈先降后增趨勢。葉片上表皮細胞，由近長方形變得扁平，排列變緊密，不規(guī)整；下表皮細胞，除整體變薄外，細胞排列緊密，不規(guī)則；角質(zhì)層細胞增厚，排列緊密，其中角質(zhì)層厚度的降幅較大，呈“V”形變化，NaCl濃度在140 mmol/L時，文冠果葉片角質(zhì)層厚度降幅最大，僅是對照組的47.42%。隨著Na2CO3濃度的增大，文冠果葉片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度，均呈下降趨勢，且Na2CO3濃度為140 mmol/L時與對照間達到差異顯著水平(P<0.05)；在Na2CO3濃度140 mmol/L時，文冠果植株受傷害程度增高，葉片厚度比對照下降了20.14%。除此之外，上、下表皮細胞厚度在Na2CO3濃度35 mmol/L時，與對照相比，上表皮厚度下降21.67%、下表皮厚度下降26.39%；但Na2CO3濃度在140 mmol/L時，上、下表皮厚度均顯著下降，僅為對照組的44.28%、61.08%，上表皮細胞排列變緊密、形狀不規(guī)整，下表皮細胞間隙變小、甚至出現(xiàn)表層破裂現(xiàn)象。隨Na2CO3濃度的增大，文冠果葉片角質(zhì)層逐漸增厚，呈先下降后上升趨勢，且處理濃度為140 mmol/L時達到最大值。

CK為清水處理(對照)；A、B、C、D，分別為中性鹽NaCl濃度為70、140、210、280 mmol/L的處理；E、F、G、H，分別為堿性鹽Na2CO3濃度為35、70、105、140 mmol/L的處理；vt為維管組織，pt為柵欄組織，st為海綿組織，ue為上表皮，de為下表皮，cu為角質(zhì)層。

表1 不同濃度鹽堿脅迫時的文冠果葉片結(jié)構(gòu)

2.2 鹽堿脅迫對文冠果葉片葉肉特征的影響

由圖1、表1可見：鹽堿脅迫對文冠果葉片葉肉結(jié)構(gòu)的影響，主要是柵欄組織厚度、海綿組織厚度，隨著NaCl濃度的增大，葉片柵欄組織厚度、海綿組織厚度、柵海比整體均呈先升后降趨勢，但在NaCl濃度為280 mmol/L時，柵欄組織厚度、柵海比又有所提高；NaCl濃度為70 mmol/L時，葉片柵欄組織厚度比對照組增加67.98%。NaCl濃度從70 mmol/L逐漸升至280 mmol/L，葉片柵欄組織厚度、海綿組織厚度均呈現(xiàn)下降狀態(tài)，柵欄組織長度減小，排列變緊密；海綿組織細胞間隙變大，出現(xiàn)較大的氣腔；NaCl對柵欄組織的影響比海綿組織更嚴重，NaCl濃度為140、210 mmol/L時，柵欄組織厚度分別降低7.66%、37.90%；值得注意的是，NaCl濃度為70、140、210 mmol/L時，柵欄組織和海綿組織的比值分別是0.97、0.65、0.56，表明葉片在變薄的情況下，柵欄組織比例減小。

Na2CO3脅迫對文冠果葉肉結(jié)構(gòu)特征影響差異較小。隨著Na2CO3處理濃度的增高，柵欄組織的細胞長度減小，組織層變??；與NaCl處理的文冠果葉片柵欄組織變緊密不同，堿性鹽Na2CO3處理，文冠果生長受抑制嚴重，葉片柵欄組織組織間變疏松，間隙變大；Na2CO3處理濃度為對照、35、70、105、140 mmol/L時，葉片柵欄組織厚度分別為25.46、25.32、24.33、21.71、20.54 μm，但差異較小，未達顯著水平。葉片海綿組織厚度隨著Na2CO3處理濃度的增大而下降，并且在高濃度Na2CO3(105、140 mmol/L)處理時，葉片海綿組織厚度分別下降了16.27%、27.72%，細胞間隙增大，出現(xiàn)發(fā)達的氣腔，高濃度的Na2CO3對海綿組織的影響大于低濃度的Na2CO3。Na2CO3處理時，文冠果葉片柵欄組織厚度、柵海比、柵欄組織和葉片厚度比，均未達顯著水平(P>0.05)；而Na2CO3濃度為140 mmol/L的處理與對照相比，葉片厚度、上下表皮厚度、角質(zhì)層厚度、海綿組織厚度達到顯著水平(P<0.05)。

2.3 鹽堿脅迫的文冠果葉片各顯微結(jié)構(gòu)相關性及主成分分析

由表2可見：在NaCl處理、Na2CO3處理中，文冠果葉片各顯微結(jié)構(gòu)之間的相關性各異，既有正相關，又有負相關。

表2 鹽堿脅迫處理的文冠果葉片各顯微結(jié)構(gòu)相關性

由表3可見：對NaCl處理的文冠果葉片的8個指標進行主成分分析，提取特征值>1的2個主成分，其特征值分別為5.640、2.042。第一主成分綜合了葉片厚度、上表皮、柵欄組織、海綿組織、柵海比、柵欄組織和葉片厚度比的信息，方差貢獻率為70.501%；第二主成分綜合了下表皮、角質(zhì)層的信息，方差貢獻率為25.526%；累計方差貢獻率達到96.027%，符合分析要求。由表4可見：在不同濃度NaCl處理時，文冠果葉片解剖結(jié)構(gòu)的綜合得分，分別為0.561、0.976、-0.403、-0.864、-0.268；依據(jù)主成分得分排序，NaCl濃度對文冠果葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響程度，由高到低依次為70、對照、280、140、210 mmol/L。

由表3可見：對Na2CO3處理的文冠果葉片的8個指標進行主成分分析，提取特征值>1的1個主成分，其特征值為6.536。第一主成分綜合了葉片厚度、上表皮、下表皮、柵欄組織、海綿組織、柵欄組織和葉片厚度比的信息，方差貢獻率為81.705%，符合分析要求。由表5可見：在不同濃度Na2CO3處理時，文冠果葉片解剖結(jié)構(gòu)的綜合得分，分別為0.776、0.559、0.221、-0.281、-1.275；依據(jù)主成分得分排序，Na2CO3濃度對文冠果葉片解剖結(jié)構(gòu)影響程度，由高到低依次為對照、35、70、105、140 mmol/L。

表3 鹽堿脅迫對文冠果葉片解剖結(jié)構(gòu)影響的方差貢獻率

表4 不同濃度NaCl處理的文冠果葉片解剖結(jié)構(gòu)綜合得分及排序

表5 不同濃度Na2CO3處理的文冠果葉片解剖結(jié)構(gòu)綜合得分及排序

2.4 鹽堿處理的文冠果葉片各顯微結(jié)構(gòu)通徑分析

以上表皮厚度(Hu,e)、下表皮厚度(He)、柵欄組織厚度(Hf,o)、海綿組織厚度(Hs,t)、角質(zhì)層厚度(Hs,c)為影響因素，以葉片厚度(Hb)為評價指標(NaCl處理的葉片厚度定義為Hb,z、Na2CO3處理的葉片厚度定義為Hb,j)，進行逐步回歸分析NaCl、Na2CO3脅迫對文冠果葉片的影響。

由表6可得：NaCl處理的回歸方程為Hb,z=14.620+1.155Hu,e+0.905He；Na2CO3處理的回歸方程為Hb,j=49.217+1.919Hu,e+0.13He+0.504Hf,o-0.014Hs,t-3.321Hs,c。通徑分析結(jié)果表明：NaCl處理時，各顯微結(jié)構(gòu)與葉片厚度的相關系數(shù)，由大到小依次為柵欄組織厚度、海綿組織厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、角質(zhì)層厚度；Na2CO3處理時，各顯微結(jié)構(gòu)與葉片厚度的相關系數(shù)，由大到小依次為上表皮厚度、下表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、角質(zhì)層厚度。植物在NaCl處理時，是柵欄組織厚度和海綿組織厚度對葉片厚度起主導作用；植物在Na2CO3處理時，是上表皮厚度和下表皮厚度對葉片厚度起主導作用。

表6 鹽堿處理的文冠果葉片顯微結(jié)構(gòu)對葉片厚度的影響系數(shù)

3 結(jié)論與討論

土壤中鹽分過高時，植物葉片水勢下降，導致氣孔導度下降[15]；除此之外，鹽害降低了光合作用速率，減少同化物與能量的供給，從而限制植物生長發(fā)育。在堿性環(huán)境中，植物除受滲透脅迫和離子毒害之外，較高pH脅迫也是傷害植物的原因之一[16]。在鹽堿土壤中，土壤溶液中離子濃度增大，pH值升高，電導率與可交換性Na比率提高，C、N的礦化度下降，土壤中酶的活性受到抑制，影響土壤微生物的活動和有機質(zhì)的轉(zhuǎn)化[17]；因而，在鹽堿環(huán)境中生長的植物，不僅要面臨鹽分過高的問題，還會產(chǎn)生副作用影響[18]；但是，植物對生存的環(huán)境具有適應能力，當生存環(huán)境改變時，植物自身通過生理生化、形態(tài)結(jié)構(gòu)上的變化去適應環(huán)境[19]；在整個進化過程中，葉片是植物重要的生命活動場所，是植物對環(huán)境反應最敏感、最明顯的器官，是反映植物對環(huán)境適應能力最重要的指標之一[20]。由于鹽分脅迫對植物葉片形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)的影響，在種間和種內(nèi)存在較大差異，不同植物對鹽分的耐受程度不同；耐鹽性較差的植物，對鹽堿的耐受性小，鹽堿環(huán)境中植物生長狀況較差[21]；具有適當耐鹽性的植物，則對低濃度的鹽脅迫反應較小[22]；鹽脅迫不同程度地促進耐鹽植物根系生長，適宜的鹽濃度能夠最大程度地促進幼苗的生長，低濃度不利于幼苗成長，在高濃度時，植物幼苗仍然能夠正常生長，只是生長速度較慢[23]。

鹽分脅迫、干旱脅迫的影響，植物葉片表現(xiàn)出極為相似的形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)[20]；在自然條件下，鹽生植物，表皮由一層平坦而排列緊密的長方形或方形細胞構(gòu)成，表面有較厚的角質(zhì)膜[24]，這種結(jié)構(gòu)可以有效地調(diào)節(jié)蒸騰和排鹽，用來適應干旱和鹽生環(huán)境。鹽堿脅迫對文冠果葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響較為復雜，是多個指標交互作用[25]。通過觀察，不同濃度中性鹽NaCl、堿性鹽Na2CO3處理的文冠果葉片解剖結(jié)構(gòu)的形態(tài)變化，隨著NaCl濃度的增加，文冠果葉片除角質(zhì)層外的各組成成分均逐漸變薄，葉片上表皮細胞由近長方形變?yōu)楸馄?、排列變緊密、不規(guī)整，葉片下表皮細胞整體變薄；角質(zhì)層厚度呈“V”字型，先顯著變薄，然后變厚，角質(zhì)層細胞增厚顯著，排列緊密，說明文冠果具有一定的耐鹽能力[26]；低濃度的NaCl對文冠果生長影響較小[27]，在高濃度下生長受抑制顯著，這與劉睿等[28]在鹽脅迫下木欖幼苗葉片解剖結(jié)構(gòu)變化研究結(jié)果一致。隨著Na2CO3脅迫濃度的增大，文冠果葉片的厚度、上表皮厚度、下表皮厚度均明顯變薄[29]，同時，上表皮細胞排列變緊密、細胞層變薄、細胞形狀不規(guī)整，下表皮細胞間隙變小，說明文冠果具有一定的耐堿能力[30]。

通過相關性分析、主成分分析、通徑分析，可以了解多個指標中的密切程度。在NaCl處理中，柵欄組織厚度、海綿組織厚度兩者均與葉片厚度呈極顯著正相關(P<0.01)，柵欄組織排列變緊密，胞間隙變??；由于柵欄組織、海綿組織在葉片中占比較大，柵欄組織、海綿組織的吸水失水，直接導致了葉片厚度的變化[31]。不同的是，在Na2CO3處理中，上表皮厚度、下表皮厚度兩者均與葉片厚度呈顯著正相關，柵欄組織厚度與海綿組織厚度之間并沒有顯著的相關性；隨著Na2CO3濃度升高，柵欄組織緊密，間隙減小，柵欄組織是細胞的“骨架”，主要起支撐作用[32]，這是因為高濃度堿性鹽Na2CO3對文冠果傷害明顯，葉片失水變薄，濃度越高，植株受傷害程度越高[33]。通徑分析結(jié)果表明，在NaCl處理時，是柵欄組織厚度、海綿組織厚度對葉片厚度起主導作用；植物在Na2CO3處理時，是上表皮厚度、下表皮厚度對葉片厚度起主導作用。

文冠果具有一定的耐鹽堿能力。根據(jù)鹽堿脅迫種類不同，植株受傷害程度不同，受傷害的部位也不相同，堿性鹽Na2CO3對文冠果的傷害大于中性鹽NaCl[34]。在中性鹽NaCl處理時，低濃度對文冠果生長有促進作用；高濃度抑制植株生長明顯，葉片柵欄組織間隙變小，組織變緊密，葉片厚度隨柵欄組織、海綿組織厚度變化顯著。在堿性鹽Na2CO3處理時，文冠果葉片柵欄組織變緊密，胞間隙減小，濃度越高，傷害越大。因此，高濃度的堿性鹽環(huán)境會在一定程度上抑制文冠果的生長。