miRNA-10a、GATA6在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及意義

余袁媛 曾新桃

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發(fā)性肝癌最為常見的類型，是我國惡性腫瘤相關(guān)死亡的主要原因［1］。HCC 的發(fā)生與長期大量飲酒、丙型病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、乙型病毒性肝炎等因素相關(guān)，我國HCC 發(fā)生的主要原因是乙型病毒性肝炎［2］?，F(xiàn)階段臨床對HCC 的發(fā)病機制及診療取得了進(jìn)展，但少數(shù)患者術(shù)后存在轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響了患者的預(yù)后［3］。因此，尋找新的腫瘤標(biāo)志物對臨床指導(dǎo)治療、準(zhǔn)確評估預(yù)后具有重要的價值。微小RNA（microRNA，miRNA）作為一類非編碼RNA，能與mRNA 結(jié)合阻斷蛋白編碼基因的表達(dá)［4］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA-10a（microRNA-10a，miRNA-10a）能進(jìn)入線粒體調(diào)控癌基因的表達(dá)，與多種惡性腫瘤的關(guān)系密切［5］。核轉(zhuǎn)錄因子GATA6（GATA-binding protein 6，GATA6）是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，有研究發(fā)現(xiàn)，GATA6 異常表達(dá)于多種腫瘤疾病中，能影響惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［6］。本研究將探討miRNA-10a、核轉(zhuǎn)錄因子GATA6在HCC 組織中的表達(dá)及意義，以期為臨床HCC診療提供參考，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2017年6月至2019年6月92 例經(jīng)手術(shù)切除治療的HCC 患者，術(shù)后取癌組織及癌旁組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：①滿足《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》［7］中診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)病理學(xué)檢查確診；②首次確診；③術(shù)前未接受免疫治療或放化療；④本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①繼發(fā)性肝細(xì)胞癌；②合并自身免疫性疾病、感染性疾病者；③存在其他惡性腫瘤者；④肝癌復(fù)發(fā)者；⑤腎、心、肺等其他重要臟器嚴(yán)重?fù)p傷者；⑥臨床病理資料不完整者。92 例HCC 患者中男性63 例，女性29 例；年齡平均（52.61±6.02）歲；TMN 分期：Ⅰ期12 例，Ⅱ期28 例，Ⅲ期52 例；分化程度：低分化43例，中分化28 例，高分化21 例；乙肝40 例，肝硬化45 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44 例；腫瘤直徑＞5 cm 30 例。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集與保存

收集HCC 患者癌組織及癌旁正常組織（距離腫瘤邊緣＞5 cm），經(jīng)快速液氮冷凍后送至標(biāo)本庫，于-80℃環(huán)境保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 miRNA-10a、核轉(zhuǎn)錄因子GATA6mRNA檢測

取50 mg 組織標(biāo)本，進(jìn)行冰上研磨，并按TRIzol 說明書進(jìn)行組織RNA 提取，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，使用分光光度計鑒定cDNA純度，確保A260/A280 在1.8～2.0，并置于-20℃冰箱儲存。TRIzol 試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自美國Invitrogen 公司，采用RT-PCR 法檢測miRNA-10a、核轉(zhuǎn)錄因子GATA6 mRNA 水平，取GAPDH 為內(nèi)參物。miRNA-10a 上游引物序列：5′-ACATCATACCCTGTAGAACCGAA-3′，下游引物序列：5′-GATTGGATGTTCTCCACAGTCTC-3′；GATA6 mRNA 上游引物序列：5′-CTCAGTTCCTACGCTTCGCAT-3′，下游引物序列：5′-GTCGAGGTCAGTGAACAGCA-3′；GAPDH 上游引物序列：5′-CTGCAGCATCTTCTCCTTCC-3′，下游引物序列：5′-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3′。擴增條件如下：95℃5 min；95℃15 s 進(jìn)行變性，60℃60 s 進(jìn)行退火，72℃5 min 30 s 進(jìn)行延伸，此為1 個循環(huán)，共進(jìn)行40 個循環(huán)，實時定量PCR 測定，以2-ΔΔCt法計算miRNA-10a、核轉(zhuǎn)錄因子GATA6mRNA 相對表達(dá)量，具體步驟嚴(yán)格遵循試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 隨訪

對患者進(jìn)行18 個月隨訪，隨訪方式為電話或門診復(fù)診，記錄隨訪結(jié)果（存活或死亡）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗；采用Cox 比例風(fēng)險回歸模型分析影響HCC 患者預(yù)后的危險因素。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC 患者癌組織及癌旁組織中miRNA-10a、GATA6 mRNA 表達(dá)水平比較

HCC 患者癌組織miRNA-10a、GATA6mRNA相對表達(dá)量高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 HCC 患者癌組織及癌旁組織中miRNA-10a、GATA6 mRNA 表達(dá)水平比較（±s）Table 1 Comparison on the expression levels of miRNA-10a and GATA6 mRNA in cancer tissues and para-cancerous tissues in HCC patients（±s）

表1 HCC 患者癌組織及癌旁組織中miRNA-10a、GATA6 mRNA 表達(dá)水平比較（±s）Table 1 Comparison on the expression levels of miRNA-10a and GATA6 mRNA in cancer tissues and para-cancerous tissues in HCC patients（±s）

組織類型癌組織癌旁組織t 值P 值n 92 92 miRNA-10a 1.97±0.35 0.65±0.13 33.911＜0.001 GATA6 mRNA 3.53±0.71 1.41±0.28 26.643＜0.001

2.2 不同臨床病理特征HCC 患者癌組織中miRNA-10a、GATA6 mRNA 表達(dá)水平比較

HCC 患者癌組織中miRNA-10a、GATA6mRNA 表達(dá)水平與TMN 分期、分化程度、乙肝、肝硬化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑有關(guān)（P＜0.05），與年齡、性別無關(guān)（P＞0.05）。見表2。

表2 不同臨床病理特征HCC 患者癌組織中miRNA-10a、GATA6 mRNA 表達(dá)水平比較［n（%）］Table 2 Comparison on the expression levels of miRNA-10a and GATA6 mRNA in cancer tissues among HCC patients with different clinicopathological characteristics［n（%）］

2.3 影響HCC 患者預(yù)后的相關(guān)因素分析

隨訪18 個月結(jié)果顯示，92 例HCC 患者，失訪2例，存活53 例，死亡37 例，存活率為58.89%。排除2 例失訪患者后采用Cox 比例風(fēng)險回歸模型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：TMN 分期增高、中高分化、乙肝、肝硬化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑≥5 cm、miRNA-10a、GATA6mRNA 表達(dá)水平過高是影響HCC 患者預(yù)后的獨立危險因素（P＜0.05）。見表3。

表3 影響HCC 患者預(yù)后的危險因素分析Table 3 Risk factors affecting prognosis of HCC patients

3 討論

HCC 早期缺乏典型癥狀，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，錯過了最佳治療時機，導(dǎo)致預(yù)后較差、生存期短［8］。因此，臨床需要尋找合理的腫瘤標(biāo)志物評估HCC 復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移風(fēng)險，進(jìn)一步為臨床HCC 治療提供依據(jù)。

miRNAs 能調(diào)控靶基因表達(dá)，對細(xì)胞生長、分化及凋亡等生理過程產(chǎn)生影響，近年來的研究表明miRNAs 與腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展等過程密切相關(guān)［9-10］。miRNA-10a 是位于17 號染色體的miRNA，與惡性腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［11］。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌患者組織中miRNA-10a 表達(dá)水平升高，且上調(diào)miRNA-10a 表達(dá)可以促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖及遷移［12］。國外研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-10a 在子宮頸癌組織中呈高表達(dá)，并可以調(diào)節(jié)靶基因-神經(jīng)細(xì)胞黏附分子，促進(jìn)宮頸癌浸潤及淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移，進(jìn)而影響預(yù)后［13-14］。有報道顯示，miRNA-10a 在胃癌中呈高表達(dá)，且可以直接靶向MAFK8IP1，調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移［15］。本研究結(jié)果顯示，HCC 患者癌組織中miRNA-10a 表達(dá)水平高于癌旁組織，提示miRNA-10a 可能作為癌基因參與了HCC 的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-10a 表達(dá)上調(diào)可能會使EphA4表達(dá)減少，進(jìn)而在一定程度上促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生侵襲及轉(zhuǎn)移［16］。本研究結(jié)果表明miRNA-10a在HCC的進(jìn)展過程中可能發(fā)揮著癌基因作用。本研究結(jié)果顯示，隨著TMN 分期的增加，miRNA-10a 表達(dá)上調(diào)，且存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的HCC 患者癌組織中miRNA-10a出現(xiàn)高表達(dá)的占比高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，這進(jìn)一步證明了miRNA-10a 參與了HCC 的侵襲和轉(zhuǎn)移。

GATA6 是位于18 號染色體的核轉(zhuǎn)錄因子，可與半限制轉(zhuǎn)錄因子通過相互作用來調(diào)控機體細(xì)胞類型特化，與多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)［17］。國外研究發(fā)現(xiàn)，GATA6 具有保守、穩(wěn)定的鋅指結(jié)構(gòu)，對腫瘤細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，對腫瘤細(xì)胞凋亡有抑制作用［18］。提示GATA6作為原癌基因在HCC患者癌組織中高度表達(dá)，與上述研究結(jié)果一致。閆江鶴等［19］認(rèn)為，癌細(xì)胞在GATA6 作用下會釋放大量的細(xì)胞黏附分子，細(xì)胞黏附分子含量升高會導(dǎo)致癌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞緊密黏附，有利于癌細(xì)胞穿透細(xì)胞外基質(zhì)層，建立轉(zhuǎn)移灶。進(jìn)一步分析結(jié)果提示GATA6 參與了HCC 的局部浸潤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，可作為HCC 發(fā)生侵襲性生物學(xué)行為的標(biāo)志物。對影響HCC 患者預(yù)后的危險因素分析可見，TMN 分期增高、中高分化、乙肝、肝硬化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑≥5 cm、miRNA-10a、GATA6mRNA 表達(dá)水平過高是影響HCC 患者預(yù)后的獨立危險因素，進(jìn)一步提示miRNA-10a、GATA6 表達(dá)與HCC 患者臨床預(yù)后的關(guān)系密切，臨床可以通過檢測miRNA-10a、GATA6 表達(dá)情況，評估HCC 患者的預(yù)后情況。

綜上所述，miRNA-10a、核轉(zhuǎn)錄因子GATA6 在HCC 患者癌組織中呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與TMN分期、分化程度、乙肝、肝硬化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑及預(yù)后有關(guān)。