馬鈴薯卷葉病毒RT-LAMP檢測方法的建立研究

甘肅省定西市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測檢測站 康明蛟

馬鈴薯作為平時人們經(jīng)常食用的食物，其質(zhì)量和健康問題非常重要，而病毒會導(dǎo)致其自身性質(zhì)退化。馬鈴暮卷葉病毒可簡稱為PLRV，對馬鈴薯來說，PLRV是影響其自身品質(zhì)的一種病毒，且影響極大，相關(guān)部門和專家學(xué)者在馬鈴薯研究方面一直以來都比較關(guān)注該病毒的檢測方式和相關(guān)對策，其目的就是能夠為馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供保障，并為人們提供品質(zhì)良好的馬鈴薯。PLRV檢測的方法有很多，其中常見的就有ELISA、RT-PCR、多重RT-PCR以及本次重點探究的RT-LAMP等等[1]。本文將以建立PLRV的RT-LAMP檢測方法為基準，對其相關(guān)事項展開深入分析，進而能夠為馬鈴薯品質(zhì)的保障提供合理化的科學(xué)依據(jù)[2]。

1 材料與方法

1.1 材料

此次實驗將會應(yīng)用到PLRV、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯M病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒以及馬鈴薯S病毒，這些樣品都屬于陽性，而陰性樣品則是以馬鈴薯脫毒種薯病毒檢測和安全評價工程技術(shù)研究中心實驗室保留的一種離體組培苗和馬鈴薯卷葉癥狀的植株葉片。

除此之外，還選擇了植物RNA提取試劑盒，RNA酶抑制劑和M—MLV反轉(zhuǎn)錄酶、重組Taq DNA聚合酶、UNG酶、dNTPMix、Bst3．0DNAPolymerase、甜菜堿(Betaine)、焦炭酸二乙酯、GeneFinderTM、硝基四氮唑藍、DAS—EUSA試劑盒購等材料。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA提取

根據(jù)植物RNA提取試劑盒操作的方法來提取病毒RNA，并測定抽提病毒RNA的濃度，隨后要在80℃的環(huán)境下進行保管，以便后續(xù)使用。采取病毒粒子吸附法來分離病毒RNA。

1.2.2 引物設(shè)計和合成

這項操作是按照Gen Bank提出的PLRVCP基因序列AY307123．1，且依照保守區(qū)域ORF3為靶標基因，通過使用PrimerExplorer4．O軟件來將6個位點設(shè)計多組RT-LAMP引物，且將Ju和Ahmadi采用的2組引物融入其中，再通過反復(fù)篩選，最終選擇適合擴增效率高的Pb組引物，可見表1，以此應(yīng)用在RT—LAMP檢測當中。而RT—PCR檢測方法則引用SN／T2627—2010∽1的引物序列，詳情可見表2，本次實驗的引物均由生物工程北京股份有限公司合成提供[3]。

表1 馬鈴薯卷葉病毒RT-LAMP檢測引物

表2：馬鈴薯卷葉病毒RT-LAMP檢測引物

1.2.3 RT—LAMP反應(yīng)體系

以報道過的RT-LAMP反應(yīng)條件確定初步反應(yīng)體系，并根據(jù)單因素試驗，來選擇引物組和引物比，并嚴格把控其濃度、反應(yīng)溫度以及反應(yīng)時間，且還需考慮到Mg、Betaine、Bst3．ODNA聚合酶、uNG、s YBR GreenI濃度多因素來形成反應(yīng)體系。

1.2.4 特異性驗證

對于馬鈴薯生長發(fā)育來說，PLRV、PVM、PVX、PVY、PVS以及PVA都是其在培育過程中極易出現(xiàn)的病毒，且并發(fā)率極高，由此可見，培育馬鈴薯的技術(shù)型要求較高，不僅要考慮土壤因素，在培育技術(shù)方面也要考慮到其各種病毒的病發(fā)率，而RT—LAMP檢測法所建起的反應(yīng)體系，在這幾種病毒中都能夠適用，特別是其陽性樣品，檢測結(jié)果更加準確[3]。在檢測之后可將RT—LAMP擴增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進行研究，且將擴增產(chǎn)物加入1L1000×SYBR GreenI，振蕩搖勻，就能夠看到其反應(yīng)結(jié)果[4]。

1.3 實驗儀器

此次實驗除了上述材料和方法以外，還會用到以下幾個實驗器材：①VORTEX-GENIE2/2T漩渦混勻儀②iCEN-24臺式高速離心機③君意-JY600C電泳儀④Tanon-3500R瓊脂凝膠成像系統(tǒng)和筆式紫外燈。

2 結(jié)果

2.1 RT-LAMP體系的建立

關(guān)于RT-LAMP方法的建立，首先要通過構(gòu)建RT-LAMP反應(yīng)體系擴增PLRV，以此來形成LAMP產(chǎn)物特殊階梯狀條帶，且空白對照與陰性對照不會形成條帶，經(jīng)過實驗研究發(fā)現(xiàn)RT-LAMP檢測結(jié)果和RT—PCR一致。但RT—LAMP反應(yīng)產(chǎn)物若加入濃度較高的(1000×)SYBR GreenI，則其樣品的顏色會發(fā)生變化，陽性為綠色，陰性則為褐色。若是加入濃度較低的(50×)SYBR GreenI，就要在紫外燈的幫助下來進行觀察，通常來說，這樣會使陽性顏色變?yōu)闊晒馍?，而陰性則不具備發(fā)出熒光色的特性。所以，RT-LAMP體系的建立，可通過以上兩種方式來確定。

2.2 特異性驗證

探究RT-LAMP檢測方法建立時，通過特異性驗證能夠看出在PLRv陽性對照下，PLRV的感染樣品在RT-LAMP的加持下，顯示為陽性，而陰性對照與沒有感染的PLRv樣品則表現(xiàn)為陰性，從這點就能夠看出RT-LAMP檢測方法和其他馬鈴薯病毒間不存在交叉性，其表現(xiàn)只是以特異性擴增PLRV為主[5]。

3 討論

在引物篩選方面，一定要選擇相符的引物來都構(gòu)建RT-LAMP反應(yīng)體系，這是其應(yīng)用的關(guān)鍵所在，若是反應(yīng)體系不夠穩(wěn)定，或是無法建立，也就不能充分發(fā)揮這種檢測方法的作用和效能。在實驗過程中，當出現(xiàn)引物擴增不穩(wěn)定的情況時，很有可能是由于引物識別、匹配以及定位方面不夠精確，存在一定的限制，進而影響到整個RT-LAMP反應(yīng)體系的穩(wěn)定性，但從此次實驗研究中發(fā)現(xiàn)，存在另一種原因，那就是由于環(huán)引物加速方面的缺失，從而使得擴增效率降低所致。因此，要想加強RT-LAMP反應(yīng)體系的穩(wěn)定性，使其在實際應(yīng)用中能夠更加快速地獲取精準的檢測結(jié)果，最好是以PLRVCP基因保守序列0RF3為主，這樣能夠?qū)Σ煌瑓^(qū)域進行引物，進而加強引物擴增率。

此次研究考慮到RT-LAMP檢測方法自身的特點和優(yōu)勢，通過深入探究其反應(yīng)體系，進而簡化該項技術(shù)的相關(guān)程序，以此來提升其應(yīng)用的高效性和便捷性，且在其成本較低、靈活度較高的特性加持下，能夠更加快速、直接且高效地對馬鈴薯卷葉病毒進行檢測。由此也能夠看出，要想使這種方法應(yīng)用到實際當中，使其作用得到體現(xiàn)，其反應(yīng)體系的建立十分重要，特別要重視反應(yīng)體系的穩(wěn)定性，這樣才能夠使檢測效果的準確性得到提升，以此來為馬鈴薯產(chǎn)品的品質(zhì)提供保障。因此，關(guān)于這種檢測方法的應(yīng)用及建立，可通過與其他檢測方法對比，并探究其擴增產(chǎn)物的效率，進而體現(xiàn)出其體系的穩(wěn)定性。實驗結(jié)果判別的方式也比較簡單，在濃度較高的SYBE GreenI加持下，通過觀察顏色變化就能夠得出相應(yīng)的結(jié)論，但此次研究考慮到成本費用方面的因素，主要是以濃度較低的SYBE GreenI為主，并通過應(yīng)用紫外燈來確保實驗結(jié)果的準確性。

4 結(jié)論

總的來說，此次研究通過對馬鈴薯卷葉病毒RT-LAMP檢測方法建立進行研究，能夠看出這種方法應(yīng)用效果良好，且其特點和優(yōu)勢都較為明顯，在實際操作當中，不僅簡便，且其檢測時效較強，靈活度高，同時，還具備低成本、高成效的特點，是一項技術(shù)性較強的檢測方法，這種方法的應(yīng)用能夠更好地檢測馬鈴薯是否帶有病毒，以此來保證馬鈴薯的品質(zhì)，為該產(chǎn)業(yè)和相關(guān)行業(yè)的發(fā)展提供了保障，值得大力推行。在實際工作當中，相關(guān)部門和專家學(xué)者們還應(yīng)對其不斷進行研究，以此來推動RT-LAMP檢測方法實現(xiàn)長期穩(wěn)定的發(fā)展，進一步證實其應(yīng)用的效果，使其能夠得到更加廣泛的應(yīng)用[6]。