朱鹮產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定和致病性

王 斌，張 娜,馮 航，王晨驍，吳 克，楊增岐 (西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)又稱魏氏梭菌，是能夠引發(fā)人和多種動(dòng)物疾病的人獸共患病原菌，為條件致病菌，嚴(yán)重威脅動(dòng)物健康和人類公共衛(wèi)生安全[1]。產(chǎn)氣莢膜梭菌致病性強(qiáng)，可引起畜禽腸毒血癥、人畜食物中毒、家畜猝疽等多種病癥。目前，該菌發(fā)現(xiàn)的外毒素有α、β、?、、γ、η、δ、θ、κ、λ、μ 和 ν等十余種，起主要致病作用的毒素有α、β、?、[2]。根據(jù)這些毒素與抗毒素的中和試驗(yàn)，分為A、B、C、D、E 5個(gè)型。近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的增大，產(chǎn)氣莢膜梭菌的流行日漸廣泛，黃牛、奶牛、綿羊、山羊、豬、雞、兔等發(fā)病報(bào)道逐漸增多，關(guān)于野生動(dòng)物產(chǎn)氣莢膜梭菌病的報(bào)道也逐漸增多[3-4]。

朱鹮(Nipponia nippon)屬鶴形目，鶴科，朱鹮屬，與大熊貓、金絲猴、羚牛并稱為四大國寶，以其稀少和外形美麗而聞名于世，是我國一級(jí)保護(hù)野生動(dòng)物，世界一級(jí)瀕危物種[5]。截止目前，尚未見朱鹮因感染產(chǎn)氣莢膜梭菌而發(fā)病死亡的報(bào)道，本研究從病死的朱鹮腸內(nèi)容物及肝臟中分離到3株革蘭陽性桿菌，經(jīng)生物學(xué)特性研究、生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)試驗(yàn)鑒定為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌，動(dòng)物致病性試驗(yàn)表明分離的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌能夠引起SPF雞特征性病理變化，證實(shí)所分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌為引起朱鹮感染死亡的病原菌。

1 材料與方法

1.1 病料陜西省兩自然保護(hù)區(qū)的數(shù)只朱鹮出現(xiàn)腹瀉死亡，剖檢可見腸道廣泛性出血，肝臟腫大質(zhì)脆色暗，無菌采樣后分別運(yùn)送死亡朱鹮小腸2份和肝臟1份至本實(shí)驗(yàn)室。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物12只SPF雞購自濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司。

1.3 試驗(yàn)試劑及培養(yǎng)基5%綿羊血-1%葡萄糖瓊脂、厭氧肉肝湯、革蘭染色液、石蕊牛乳、卵磷脂培養(yǎng)基，均參照文獻(xiàn)[6]配制；藥敏紙片購自楊凌俊揚(yáng)生物科技有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒和部分生化試驗(yàn)管購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；2×Taq PCR Master Mix和DL2000 DNA Marker購自Genstar；瓊脂糖、瓊脂、營養(yǎng)瓊脂等均為國產(chǎn)試劑。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成16S rRNA引物由西安擎科澤西生物技術(shù)有限公司合成；針對(duì)魏氏梭菌主要毒素基因序列，參考公開發(fā)表的引物序列合成引物(表1,2)[7]。

表1 16S rRNA引物信息

1.5 細(xì)菌的分離培養(yǎng)無菌采集死亡朱鹮的肝臟和小腸內(nèi)容物，制成組織抹片后革蘭染色鏡檢，同時(shí)分別取小塊肝臟和腸內(nèi)容物放入無菌離心管中，80℃水浴15 min，離心取上清加至厭氧肉肝湯中37℃培養(yǎng)18～24 h，離心，用接種環(huán)蘸取沉淀接種至5%綿羊血-1%葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)36 h，觀察菌落形態(tài)。

1.6 生化試驗(yàn)將分離的可疑純培養(yǎng)物接種于牛乳培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，觀察記錄生化反應(yīng)結(jié)果。

1.7 分子生物學(xué)試驗(yàn)

1.7.1細(xì)菌16S rRNA PCR檢測 將純化的細(xì)菌接種于10 mL的厭氧肉肝湯，37℃培養(yǎng)12 h，取5 mL 菌液12 000 r/min離心1 min后，根據(jù)細(xì)菌DNA提取試劑盒操作步驟提取DNA。PCR反應(yīng)體系:2×Taq PCR Master Mix 10 μL，10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，細(xì)菌DNA 2 μL，無菌雙蒸水補(bǔ)至總體積20 μL。反應(yīng)程序：94℃ 5 min,94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并送至西安擎科生物有限公司測序。

1.7.2多重PCR鑒定毒素類型 以1.7.1提取的細(xì)菌DNA為PCR模板，引物的濃度分別為Cpa:10 μmol/L，Cpb、Ext、Ia20 μmol/L；PCR反應(yīng)體系：2×Taq PCR Master MiX 16 μL，不同濃度Cpa、Cpb、Ext、Ia的上、下游引物各1 μL，細(xì)菌DNA 2 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)至總體積為50 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 10 min；94℃ 30 s，51.6℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠成像系統(tǒng)下觀察條帶，同時(shí)PCR產(chǎn)物送至西安擎科生物有限公司測序。

1.8 動(dòng)物致病性試驗(yàn)將12只21日齡SPF雞每組3只隨機(jī)分為4組，其中2～4組為試驗(yàn)組，1組為對(duì)照組。3株分離菌株分別使用無菌生理鹽水稀釋至1.5×108CFU/mL，試驗(yàn)組SPF雞腹腔分別注射各菌株菌液0.5 mL，對(duì)照組腹腔注射0.5 mL無菌生理鹽水。

1.9 分離菌的藥敏試驗(yàn)將分離菌株用無菌生理鹽水稀釋至0.5麥?zhǔn)现?，用無菌棉簽將菌液均勻涂布至5%綿羊血-1%葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，貼附藥敏片后,置37℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24～48 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，參考美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)頒布的《抗微生物藥物敏感性實(shí)驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》判定藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

2.1.1鏡檢結(jié)果 3只病死朱鹮腸及肝臟抹片，革蘭染色鏡檢均可見革蘭陽性，散在或成對(duì)存在有莢膜的桿菌，菌體兩端鈍圓[8]，基本無鏈狀排列(圖1)。

2.1.2菌落形態(tài)觀察 將朱鹮組織加入?yún)捬跞飧螠囵B(yǎng)5 h后，肉肝湯變渾濁且不斷有氣泡產(chǎn)生。將培養(yǎng)18 h后的肉肝湯培養(yǎng)物接種到葡萄糖血瓊脂37℃厭氧培養(yǎng)36 h后，血平板上可見大小為2～4 mm，灰白色，圓形，邊緣整齊[9]，表面光滑半透明呈圓屋頂狀的菌落，菌落周圍呈現(xiàn)雙溶血環(huán)，在空氣中暴露一段時(shí)間后菌落變?yōu)榈G色(圖2)。

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果通過菌落特征和染色鏡檢，以及生化試驗(yàn)結(jié)果與《伯杰細(xì)菌手冊》對(duì)比發(fā)現(xiàn)，分離菌株與產(chǎn)氣莢膜梭菌高度相似(表3)。

表3 3株產(chǎn)氣莢膜梭菌的生化鑒定結(jié)果

2.3 細(xì)菌16S rRNA PCR鑒定對(duì)3株分離株的16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外成像系統(tǒng)中可見約1 300 bp大小的條帶(圖3)。登錄NCBI網(wǎng)站將測得的16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性檢索，結(jié)果表明同源性達(dá)98%以上，確定為產(chǎn)氣莢膜梭菌。

M.DL2000 DNA Marker;1.Cp1;2.Cp2;3.Cp3;4.陰性對(duì)照圖3 16S rRNA的PCR鑒定結(jié)果

2.4 毒素基因型鑒定經(jīng)多重PCR對(duì)3株分離株毒素分型結(jié)果顯示，3株均僅擴(kuò)增出1條約325 bp 大小的α毒素條帶(圖4)，表明3株分離株均為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌。

M.DL2000 DNA Marker;1.Cp1;2.Cp2; 3.Cp3;4.D型魏氏梭菌陽性對(duì)照菌株圖4 產(chǎn)氣莢膜桿菌分離株多重PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.5 動(dòng)物致病性試驗(yàn)3組試驗(yàn)組SPF雞于攻毒后4 h陸續(xù)出現(xiàn)精神萎靡，食欲、飲欲減退，呆立不動(dòng)等癥狀，6 h后陸續(xù)死亡，對(duì)照組SPF雞未見異常。剖解病死雞可見腸道鼓氣，腸壁變薄，腸道黏膜出血性壞死，呈壞死性腸炎肝臟色澤變黑易碎。無菌采集腸道及肝臟等組織制備抹片，革蘭染色鏡檢可見革蘭陽性，有莢膜，散在或成對(duì)存在桿菌，病變腸道和肝臟經(jīng)細(xì)菌分離鑒定獲得產(chǎn)氣莢膜梭菌。

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，3株分離菌對(duì)青霉素、氨芐西林、頭孢噻呋、萬古霉素、氧氟沙星、四環(huán)素抗菌藥敏感，對(duì)丁胺卡那、新霉素完全耐藥，對(duì)紅霉素、麥迪霉素、克林霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明出現(xiàn)不同程度的耐藥(表4)。

表4 分離菌Cp1、Cp2、Cp3藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

產(chǎn)氣莢膜梭菌為條件致病菌，可正常存在于動(dòng)物腸道[10]，當(dāng)腸道內(nèi)容物酸堿度和氧飽和度等內(nèi)環(huán)境因素改變時(shí)，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)氣莢膜梭菌的大量增殖而引起發(fā)病，其中氣候驟變、高蛋白飲食、飼料更換等為常見誘因[11]，在動(dòng)物日常飼養(yǎng)管理中應(yīng)加以重視。

本試驗(yàn)從朱鹮組織臟器分離3株產(chǎn)氣莢膜梭菌均為含α毒素的A型菌株，動(dòng)物致病性試驗(yàn)表明α毒素具有極強(qiáng)的致病性，證實(shí)所分離的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌為引起3只朱鹮死亡的病原菌。藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，3株分離菌對(duì)丁胺卡那、新霉素完全耐藥，對(duì)紅霉素、克林霉素、慶大霉素呈現(xiàn)出不同程度的耐藥，其中Cp1和Cp2有多重耐藥特點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果合理使用抗生素進(jìn)行治療，同時(shí)應(yīng)引起對(duì)野生動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性的重視。

本研究系對(duì)朱鹮產(chǎn)氣莢膜梭菌感染引發(fā)死亡的首次報(bào)道，以期引起對(duì)野生動(dòng)物產(chǎn)氣莢膜梭菌感染致死以及野生動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性的關(guān)注，試驗(yàn)中涉及的細(xì)菌分離鑒定、毒素分型、藥物敏感性試驗(yàn)等方法，均能夠?qū)σ吧鷦?dòng)物產(chǎn)氣莢膜梭菌的理論研究和綜合防治提供重要參考。