抗登革病毒人源化單克隆抗體h1A1D的構(gòu)建及純化

劉宇夢(mèng)，汪 偉，孫世宇，于 寧，李成輝，莊忻雨，孫文超，魯會(huì)軍*，金寧一* (1.廣西大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧530001；.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長(zhǎng)春1301；3.延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000；4.溫州大學(xué) 病毒學(xué)研究所，浙江 溫州 35035)

登革病毒(dengue virus，DENV)是一種重要的蚊媒傳染病病毒，屬于黃病毒科黃病毒屬，主要的傳播媒介是埃及伊蚊和白紋伊蚊[1]，DENV感染可引起不同程度的臨床癥狀，從無(wú)感染癥狀到有嚴(yán)重的登革出血熱和登革休克綜合征，并可能導(dǎo)致死亡[2-3],死亡率高達(dá)10%[4]。登革熱已成為一個(gè)全球性的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問(wèn)題[5-6]。

DENV有4種血清型(DENV1～DENV4)，每種血清型中又有多個(gè)基因型[7]，主要以DENV2型流行[8- 9]。DENV為單股正鏈RNA病毒，含有1個(gè)開(kāi)放閱讀框，編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白(C、pr M和E)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白[10]。有研究表明，DENV自然感染過(guò)程中誘導(dǎo)的抗體明顯以包膜(E)和膜前(pr M)蛋白為靶點(diǎn)[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，DENV單克隆抗體h1A1D 能識(shí)別ED Ⅲ上的表位，且對(duì)4種血清型具有中和活性[13-15]。鼠源性抗體作為異源蛋白應(yīng)用于人體會(huì)引起針對(duì)異源蛋白的免疫排斥反應(yīng)，誘發(fā)產(chǎn)生人抗鼠抗體，縮短了抗體在體內(nèi)的半衰期影響了抗體的治療效果引起人抗鼠抗體(human anti-mouse antibody，HAMA)反應(yīng)[16-17]。人源化單克隆抗體已經(jīng)成為治療性抗體藥物研究的重要方向，因此，需研發(fā)一種具有廣譜抗DENV中和活性的單克隆抗體。

本研究參考 GenBank公布的抗體序列，通過(guò)基因工程技術(shù)將DENV鼠源單克隆抗體輕重鏈可變區(qū)氨基酸序列與人源抗體輕重鏈恒定區(qū)氨基酸序列合成至pcDNA 3.1(+)載體上，轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞進(jìn)行抗體表達(dá)，Protein A親和純化后，成功制備了抗DENV人源化單克隆抗體h1A1D，本研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步探索DENV致病機(jī)制及研發(fā)登革熱的抗體藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO-K1細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒提取試劑盒、DL5000 DNA Marker均購(gòu)自Sigma公司；F-12培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；Protein A親和純化介質(zhì)購(gòu)自美國(guó)GE公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自PROTEINSIPMLE公司。

1.2 人源化抗體的構(gòu)建DENV鼠源單克隆抗體m1A1D輕鏈和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列來(lái)自 PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)，PDB：2R69L，2R69H。人源抗體輕鏈和重鏈恒定區(qū)氨基酸序列根據(jù)NCBI上已發(fā)表的序列(GenBank登錄號(hào)：MN200291.1，AY623427.1)。按照?qǐng)D1所設(shè)計(jì)的抗體結(jié)構(gòu)合成人源化抗體h1A1D基因序列。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

圖1 人源化抗體設(shè)計(jì)圖

1.3 人源化抗體h1A1D的真核表達(dá)載體的構(gòu)建將DENV鼠源單克隆抗體m1A1D重鏈和輕鏈可變區(qū)和人源抗體重鏈和輕鏈恒定區(qū)合成連接后，再合成至pcDNA3.1(+)載體上。最后得到h1A1D-pcDNA3.1(+)VH/CH、h1A1D-pcDNA3.1(+)VL/CL質(zhì)粒，克隆至含氨芐青霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10 h；提取重鏈和輕鏈表達(dá)載體質(zhì)粒。用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ雙酶切進(jìn)行酶切鑒定，酶切鑒定正確后，用質(zhì)粒大量提取試劑盒提取輕重鏈質(zhì)粒后，用微量分光光度計(jì)測(cè)定其質(zhì)量濃度，-40℃ 保存。

1.4 人源化單克隆抗體的表達(dá)及純化

1.4.1人源化單克隆的轉(zhuǎn)染及壓力篩選 將1×106CHO-K1細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別將抗體的重鏈和輕鏈表達(dá)質(zhì)粒各1 μg和2 μL 轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染72 h后，離心收集培養(yǎng)上清，SDS-PAGE檢測(cè)抗體是否表達(dá)，確定表達(dá)后，陽(yáng)性孔細(xì)胞更換含14 g/L G418的選擇培養(yǎng)基篩選抗性克隆。

1.4.2抗體的純化 將具有抗性克隆的培養(yǎng)基，離心取上清，用0.22 μm膜過(guò)濾，柱平衡：用10倍體積的PBS( pH 7.5 )清洗Protein A柱。上樣：將樣品加入上樣至柱床，收集液體(此液體簡(jiǎn)稱流穿液)?？贵w洗脫：輕輕在柱床上加入洗脫液(20 mm檸檬酸pH 2.7緩沖液)；用中和液(1 mol/L Tris-HCl,pH 9.0)中和，承接時(shí)宜多管順次接取，并記錄順序。洗脫完畢后，用PBS平衡柱子?？贵w用PBS(pH 7.2)透析3次，每次4 h以上。透析結(jié)束后用0.22 μm膜過(guò)濾，分裝，-80℃保存。透析后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳分析h1A1D抗體的相對(duì)分子質(zhì)量大小和純度分析。

1.5 SDS-PAGE蛋白電泳及染色蛋白樣品制備：取純化的洗脫液以及純化后的抗體，加入蛋白上樣緩沖液，還原電泳的樣品置于沸水浴10 min；SDS-PAGE蛋白電泳后，考馬斯亮藍(lán)快速染色液染色，脫色，完成脫色后觀察結(jié)果。

1.6 Western blot分析結(jié)合活性Western blot分析h1A1D抗體的結(jié)合活性，用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建含有4種血清型DENV ED3蛋白串聯(lián)基因的4D蛋白Western blot檢測(cè)其結(jié)合活性，以h1A1D 抗體測(cè)定其結(jié)合。

2 結(jié)果

2.1 單抗輕、重鏈質(zhì)粒的鑒定對(duì)合成的h1A1D-pcDNA3.1(+)VH/CH、h1A1D-pcDNA3.1(+)VL/CL質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，獲得的重、輕鏈抗體大小分別約為1 800，900 bp，與預(yù)期大小一致(圖2)。

M.DL5000 DNA Marker；1.h1A1D重鏈完整基因片段( Hind Ⅲ/EcoRⅠ)；2.h1A1D輕鏈基因片段(Hind Ⅲ/EcoRⅠ ) 和pcDNA3.1(+)載體片段( Hind Ⅲ/EcoRⅠ)圖2 h1A1D- pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的 Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ雙酶切鑒定結(jié)果

2.2 抗體的純化和表達(dá)鑒定將輕、重鏈表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，經(jīng) G418 壓力篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)人源化h1A1D抗體的細(xì)胞系，擴(kuò)大培養(yǎng)后，進(jìn)行Protein A 親和抗體純化，收集洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE 檢測(cè)，結(jié)果如圖3A所示，目的抗體蛋白得到了有效的濃縮和純化；將純化后得到的h1A1D抗體分別利用還原膠和非還原膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析h1A1D抗體的相對(duì)分子質(zhì)量大小。如圖3B、C所示，h1A1D二價(jià)抗體的輕、重鏈大小分別為 30，55 kDa，完整抗體約 190 kDa，與預(yù)期大小一致。純化后抗體的蛋白質(zhì)量濃度均為1.42 g/L。

A，C.非還原膠SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳分析；B.還原膠SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳分析 MW.蛋白 Marker；IN.細(xì)胞培養(yǎng)上清；FT.流出液；W.洗脫液；E.洗脫部分圖3 Anti-h1A1D純化結(jié)果

2.3 抗體的純化和表達(dá)鑒定首先，抗體含有4種血清型DENV ED3蛋白串聯(lián)基因的4D蛋白進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示，1A1D能特異結(jié)合抗原(圖4)，說(shuō)明本研究構(gòu)建的人源化嵌合抗體h1A1D具備了結(jié)合活性。

M.蛋白Marker;1.細(xì)胞培養(yǎng)上清；2.含有4種血清型的4D蛋白圖4 h1A1D抗體特異結(jié)合檢測(cè)

3 討論

目前DENV感染率和病死率仍在不斷增加[16]，每年全球約有4億人感染DENV，其中約有1億人出現(xiàn)不同程度的癥狀[18]。由于尚未發(fā)現(xiàn)能夠用于臨床的針對(duì)登革熱感染的抗病毒藥物，對(duì)于該傳染病的治療僅僅是對(duì)癥治療。有文獻(xiàn)報(bào)道針對(duì)DENV的特異性抗體的研制已經(jīng)持續(xù)了40 多年，從 20世紀(jì) 80 年代開(kāi)始的鼠源抗體到現(xiàn)在的全人源單克隆抗體[19]，DENV的中和抗體需要足夠高效，且最好能同時(shí)中和4種血清型的病毒[20]。本研究的目的是為后期獲得廣譜、高效且特異性好的DENV抗體奠定基礎(chǔ)。

目前DENV在同一地區(qū)存在不同血清型的交叉感染，因此需要能同時(shí)有效中和4種血清型的抗體[21]。而單克隆抗體 1A1D 識(shí)別 EDⅢ上的表位，通過(guò)抑制病毒同細(xì)胞表面受體的結(jié)合而預(yù)防感染，對(duì) DENV1-3都具有中和保護(hù)活性。因此本試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的h1A1D單克隆抗體目的在于通過(guò)基因工程技術(shù)來(lái)對(duì)人源的單克隆抗體和鼠源的單克隆抗體進(jìn)行改造，獲得人源化的單克隆抗體，Western blot結(jié)果顯示，h1A1D能特異結(jié)合抗原，說(shuō)明本研究構(gòu)建的人源化嵌合抗體h1A1D具備了結(jié)合活性。

本試驗(yàn)選擇pcDNA3.1真核表達(dá)載體構(gòu)建h1A1D-pcDNA3.1(+)重組表達(dá)載體，這與原核表達(dá)載體相比，雖然不能一次性獲得大量的蛋白，但是真核細(xì)胞中表達(dá)蛋白具有高活性。本研究旨在獲得純化的h1A1D，采用protein A親和層析純化方法，此操作簡(jiǎn)單、簡(jiǎn)易、有效，整個(gè)純化過(guò)程操作時(shí)間短，較高程度的降低了蛋白降解的可能性，較好的保持了蛋白本身的活性。

本研究將登革鼠源抗體h1A1D重、輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與人源抗體重鏈和輕鏈恒定區(qū)氨基酸序列合成到pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞進(jìn)行抗體表達(dá)，親和純化后，成功制備了抗DENV人源化單克隆抗體h1A1D。