黔產橢圓葉花錨HPLC指紋圖譜研究

何 羽 熊燦瓊

貴州省畢節(jié)市市場監(jiān)督管理局檢驗檢測中心，貴州 畢節(jié) 551700

橢圓葉花錨為龍膽科植物橢圓葉花錨HaleniaellipticaD.Don的干燥全草。為我省少數民族用藥，收載于《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》(2003 版)，貴州習稱黑耳草[1]、阿小根、龍膽、青魚膽、肝炎藥、黑節(jié)苦草、雞腳蓮、花錨、甲地然果、四棱草、小兒腫消、花臉錨等。據文獻記載[2-3]，我國花錨植物共2種1變種，即橢圓葉花錨HaleniaellipticaD.Don(包括原變種卵萼花錨H.ellipticavar.elliptica及變種大花花錨H.ellipticavar.grandiflora)和花錨H.corniculata(Linn)Comaz?；ㄥ^H.corniculata(Linn)Comaz主要分布于內蒙東北部、華北地區(qū)[8]；橢圓葉花錨HaleniaellipticaD. Don主產于西藏、青海、云南、陜西、甘肅、四川、云南、貴州省等。根文獻報道[4-11]：橢圓葉花錨含有多種化學成分，主要有酮類、酮苷類、黃酮苷類、裂環(huán)烯醚萜類、三萜類以及甾體類成分。較多文獻報道對其中的齊墩果酸進行含量測定[5]，僅測定單一成分的含量，并不能有效的對其質量進行全面評價，因此，本文擬建立HPLC指紋圖譜，以便更加全面的評價黔產橢圓葉花錨的質量。

2 方法與結果

2.1 材料

2.1.1 儀器與試藥 Waters e2695高效液相色譜儀；AY-120型電子分析天平(日本島津公司)；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)；乙醇、磷酸為分析純，甲醇、乙腈為色譜純，試驗用水為純化水；齊墩果酸對照品(中國食品藥品檢定研究院 批號：110709-201808)。

2.1.2 樣品信息 橢圓葉花錨采自貴州省各地區(qū)，經貴州省藥品檢驗所中藥學專家李楊老師鑒定為為龍膽科植物橢圓葉花錨HaleniaellipticaD. Don，樣品除去泥沙，曬干，粉碎，過四號篩，備用。 樣品詳情見表1。

表1 樣品信息

2.2 試驗與結果

2.2.1 色譜條件 Camesil C18色譜柱(250×4.6 mm，5 μm)；以25%甲醇為流動相A，乙腈為流動相B，按下表進行梯度洗脫；流速：1.0 mL；檢測波長258 nm，柱溫：40 ℃。(見表2)

表2 流動相梯度變化表

2.2.2 對照品溶液的制備 取齊墩果酸對照品對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取橢圓葉花錨細粉1 g，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，稱定重量，水浴加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，用0.45 μm的微孔濾膜，即得。

2.2.4 精密度考察 取同一藥材粉末(S1)約1 g，按2.2.3項下方法制成供試品溶液，按2.2.1項下的色譜條件進樣測定，測得各共有色譜峰相對保留時間和相對峰面積RSD(%)分別為1.05%與1.24%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.2.5 重復性考察 取同一藥材粉末(S1)6份，每份約1 g，按2.2.3項下方法制成供試品溶液，按2.2.1項下的色譜條件進樣測定，測得各共有色譜峰相對保留時間和相對峰面積RSD(%)分別為1.59%與1.38%(n=6)，表明本方法的重復性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性考察 取同一藥材粉末(S1)約1 g，按2.2.3項下方法制成供試品溶液，按2.2.1項下的色譜條件進樣測定，于0、2、4、8、12、24、48 h分別依次進樣測定，測得各共有色譜峰相對保留時間和相對峰面積的RSD(%)分別為1.42%與1.61%，均小于2.0%，達到規(guī)定要求，表明供試品溶液在48 h內穩(wěn)定。

2.2.7 特征峰的確定 根據12批黔產橢圓葉花錨藥材的HPLC圖譜的測定結果，共分離出23個色譜峰，將樣品的HPLC圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相相似度評價系統(tǒng)(2012版)”進行分析，多點校正，時間窗寬度為0.1，對照圖譜生成為中位數，生成黔產橢圓葉花錨藥材HPLC對照指紋圖譜，共指認了14個共有色譜峰。根據齊墩果酸對照品與樣品的HPLC色譜圖及對應色譜峰的保留時間及UV光譜圖進行對比分析，確認12號峰為齊墩果酸峰，且均達到了基線分離，峰信號較強。如圖1所示。

圖1 HPLC特征色譜圖

2.2.8 相似度計算及結果分析 將生成的對照圖譜與12批樣品的HPLC色譜圖分別導入“中藥色譜指紋圖譜相相似度評價系統(tǒng)(2012版)”進樣分析，計算相似度，結果見表3。

表3 12批樣品的相似度結果

12批黔產橢圓葉花錨藥材的相似度均在0.90以上，說明各品種之間相似度較高，樣品質量比較穩(wěn)定，所建立的HPLC指紋圖譜具有一定的代表性與實用性。

2.3 討論與小結

2.3.1 檢測波長的選擇 采用Waters PDA檢測器在200～400 nm的波長范圍內進行全波段掃描，結果在258 nm的波長處時，HPLC色譜圖信息量較大，峰形較好，對照品與相鄰雜質峰之間均達到基線分離，空白溶液無干擾。

2.3.2 流動相的選擇 分別考察了甲醇-水，甲醇-0.2%磷酸溶液，乙腈-水，乙腈-0.2%磷酸溶液，25%甲醇-乙腈等流動相體系，經反復優(yōu)化調整后梯度洗脫比例，結果25%甲醇-乙腈做流動時相色譜圖分離效果最佳。

2.3.3 樣品溶液提取方法選擇 樣品分別采用不同濃度的甲醇和乙醇作溶劑水浴回流1～3 h不等，經試驗發(fā)現，甲醇作溶劑時，雜質峰干擾較小，水浴回流2 h，供試品成分提取較完全，色譜峰信息量較大，故選擇用甲醇作溶劑，水浴回流2 h進行供試品溶液的制備。

2.3.4 相似度評價 建立HPLC指紋圖譜，并對12批樣品進行相似度評價，結果12批樣品的相似度均在0.90以上，采用龍膽科植物其他屬種的藥材進行相互驗證，結果相似度較低，表明該指紋圖譜能系統(tǒng)地闡明黔產橢圓葉花黔錨藥材內在的品質特征，以期能為該藥材的質量控制提供參考。